Автореферат (1090325), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Влияние межмолекулярных контактов в димерном интерфейсе белкана ферментативные свойства r12/15-LOX. Для изучения влияния межмолекулярныхконтактов интерфейса в димере r12/15-LOX на функциональные свойства r12/15-LOXбыла изучена кинетика окисления АК и ЛК под действием препаратов фермента дикоготипа, а также мутантов W181E+H585E и L183E+L192E. Кинетика реакции ферментадикого типа с природными субстратами описывались уравнением Михаэлиса-Ментена вдиапазоне концентраций до 80 мкм. Для ЛК и АК были получены величины К*М 21,3±3,6Таблица 11. Кинетические параметры ферментативной реакции r12/15-LOX,W181E+H585E и L183E+L192E мутантов.ферментЛКkcat,с-1дикий типW181E+H585E47,23±2,83АКkcat/K*M,с-1мкМ-12,21±0,13субстратное ингибированиеkcat,с-111,26±0.56kcat/K*M,с-1мкM-11,38±0.16субстратное ингибированиеH585E21,20±3,111,07±0,1615,78±0.873,20±0.41W181E39,84±6,221,61±0,2554,40±2.018,32±0.51L183E+L192Eсубстратное ингибированиесубстратное ингибированиемкм и 15,5±1,5 мкМ.
Максимальные скорости каталитического цикла (kcat) составили47,23±2,83 с-1 и 11,26±0,56 с-1 (рис. 23A), соответственно. Напротив, кинетикаферментативной реакции двойных мутантов не описывалась законом МихаэлисаМентена даже в области низких концентраций субстрата. Оба мутанта подвергались ярковыраженной инактивации по мере увеличения концентрации субстрата выше 5-15 мкм(рис.
23А и 23Г). Аналогичный эффект наблюдался в присутствии аллостерическогоэффектора, 13(S)-НрODE (рис. 23E). В мономерах r12/15-LOX (PDB 2P0M), как вконформере А, так и в конформере Б, боковые цепи аминокислотных остатков по местувведения мутации должны находиться в контакте с растворителем, что делает маловероятным какие-либо существенные изменения в активном центре фермента врезультате мутаций.
С другой стороны, как показано на примере W181E+H585E,корреляция между концентрацией белка и количеством субстрата, необходимым дляинактивации фермента (рис. 23В), предполагает прямое субстратное ингибирование.Мутация Н585Е оказывала минимальный эффект на окисление как ЛК, так и АК (рис. 23Би 23 Д; табл. 11), тогда как при использовании АК в качестве субстрата, замена Trp181 наглутаминовую кислоту, по сравнению с ферментом дикого типа, вызывала семикратноеувеличение эффективности катализа с участием мутанта (kcat/K*M) (рис 23Д; табл. 11). Приэтом скорости окисления ЛК и АК в области низких концентраций субстрата становилисьсопоставимыми.Изучение траекторий флуктуации полиеновой цепи субстрата в комплексе с r12/15LOX показывает, что терминальная часть молекулы АК, находящаяся вблизиаминокислотных остатков Ile593/Ile597спирали α18, практически зажата, тогда как цепь ЛК45обладает большей степенью свободы.
Подытоживая полученные данные можнозаключить, что в случае, когда две молекулы фермента r12/15-LOX работают совместно,Рис. 23. Кинетические кривые зависимости скорости ферментативной реакцииr12/15-LOX, W181E+H585E и L183E+L192E мутантов от концентрации субстрата.Trp181 за счет своей объемной боковой цепи создает стерические затруднения вкоординации мономеров (2 и 18 спиралей) димерного комплекса фермента с АК, чтоделает более короткую молекулу ЛК предпочтительным субстратом. Результатыструктурно-кинетических исследований показывают, что дестабилизация интерфейсадимера вследствие мутации приводит к нарушению функциональных свойств фермента,в результате которых наблюдается сильное ингибирование фермента субстратом.
До техпор, пока оба конформера А и Б фермента дикого типа сохраняют межмолекулярныйконтакт, гидрофобные 2 спирали защищены от доступа молекул воды. В случаераскрытия интерфейса по месту мутаций спирали 2 вступают в контакт с избыточнымколичеством ПНЖК или их продуктов, что сопровождается инактивацией фермента. Этопредположение подкрепляется литературными данными, показывающими возможностьковалентноймодификацииаминокислот2продуктом окисления АК (15(S)-HpETE).46спирали12/15-LOXферментативнымВыводы1.Предложен дизайн и осуществлен синтез новых зондов активного центра r12/15-LOXна основе региоизомерных производных АК в качестве фотоаффинных маркеров, атакжеингибиторовлипоксигеназ.Впервыеосуществленсинтез-4гидроксилированных ПНЖК на основе их ацетиленовых предшественников.2.Разработаны рациональные и технологичные подходы введения тритиевой метки вструктуру зондов активного центра r12/15-LOX.
Показано, что наличие бензоатов(OBz) в качестве защиты ОН-группы в непосредственной близости от тройной связипрепятствует каталитическому восстановлению последней.3.Показанаустойчивостьрегиоизомерныхвторичныхазидопроизводныхарахидоновой кислоты в условиях каталитического восстановления на катализатореЛиндлара в апротонных растворителях.4.Детально изучены процессы фермент-субстратного связывания с использованиемполученных соединений, разработаны и оптимизированы условия для введенияфотоаффинной метки в r12/15-LOX.5.Предложена расширенная кинетическая модель липоксигеназной реакции,предполагающая участие молекулярного кислорода в процессах активациифермента и создана подробная модель, описывающая механизм транспортакислорода в r12/15-LOX.6.С применением стратегии направленного мутагенеза, МРР, методов круговогодихроизма и динамической флуоресценции изучено взаимодействие между Nтерминальным доменом и каталитической субъединицей и показана рольмеждоменного взаимодействия в структуре фермента.7.Впервые показана роль аллостерического эффектора (13(S)-H(p)ODE) в качествемолекулярного триггера, который сдвигает динамическое равновесие в рядумономер–димер между молекулами фермента в водной среде в сторонуобразования переходного димерного комплекса.8.С использованием методов молекулярной динамики и компьютерногомоделирования показана стабильность переходных димерных комплексов r12/15LOX в присутствии связанного субстрата (АК).9.Предложена новая структурная модель липоксигеназного катализа, котораяпредусматривает образование переходных димеров фермента в качествекаталитически активной единицы на предкаталитической стадии.Список публикаций автора по теме диссертации:1.2.Обзоры:Kuhn H., Saam J., Eibach S., Holzhütter H.-G., Ivanov I., Walther M.
Structural biology ofmammalian lipoxygenases: Enzymatic consequences of targeted alterations of the proteinstructure. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, V. 338, P. 93-101.Ivanov I., Heydeck D., Hofheinz K., Roffeis J., O'Donnell V.B., Kuhn H., Walther M.Molecular enzymology of lipoxygenases. // Arch. Biochem. Biophys. 2010, V. 503, P.16174.473.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.Иванов И.В, Гроза Н.В., Мягкова Г.И., Кюн Х. Структурная биология липоксигеназ:настоящее и перспективы развития.
// Вестник МИТХТ. 2014, T. 9, C. 3-26.Ivanov I., Kuhn H., Heydeck D. Molekular and structural biology of arachidonic acid 15Lipoxygenase (ALOX15). // Gene. 2015, V. 573. P. 1-32.Экспериментальные статьи:Walther M., Ivanov I., Myagkova G.I., Kuhn H. Alterations of lipoxygenase specificity bytargeted substrate modification and site-directed mutagenesis. // Chem. Biol. 2001, V. 8, P.779-790.Ivanov I., Romanov S.G., Groza N.V., Nigam S., Kuhn H., Myagkova G.I. A Simplemethod for preparation of (5Z, 8Z, 11Z, 14Z)-16-hydroxyeicosa-5,8,11,14-tetraenoic acidenantiomers and the corresponding 14,15-dehydro analogues: role of the 16-hydroxygroup for the lipoxygenase reaction.
// Bioorg. Med. Chem. 2002, V. 10, P. 2335-2343.Romanov S.G., Ivanov I., Groza N.V., Kuhn H., Myagkova G.I. Total synthesis of(5Z, 8Z, 11Z, 14Z)-18- and 19-oxoeicosa-5,8,11,14-tetraenoic acids. // Tetrahedron. 2002,V. 58, P. 8483-8487.Groza N.V., Ivanov.V., Romanov S.G., Myagkova G.I., Nigam S. A Novel synthesis of3(R)-HETE, 3(R)-HTDE and enzymatic synthesis of 3(R),15(S)-DiHETE. // Tetrahedron.2002, V.
58, P. 9859-9863.Ivanov I., Romanov S.G., Shevchenko V.P., Rozhkova E.A., Maslov M.A., Groza N.V.,Myasoedov N.F., Kuhn H., Myagkova G.I. A convergent syntesis of(17R, 5Z, 8Z, 11Z, 14Z)-17-hydroxyeicosa-5,8,11,14-tetraenoic acid analogues and theirtritiated derivatives. // Tetrahedron. 2003, V. 59, P. 8091-8097.Romanov S.G., Ivanov I., Shevchenko V.P., Nagaev I.Yu., Pushkov A.A., Myasoedov N.F.,Myagkova G.I., Kuhn H. Synthesis of (5Z, 8Z, 11Z, 14Z)-18- and 19-azidoeicosa5,8,11,14-tetraenoic acids and their [5,6,8,9,11,12,14,15-3H8]-analogues through acommon synthetic route. // Chem. Phys. Lipids.
2004, V. 130, P. 117-126.Ivanov I., Romanov S., Odzdoba Ch., Holzhutter H.-G., Myagkova G., Kuhn H. /Enantioselective substrate specificity of 15-lipoxygenases. // Biochemistry. 2004, V. 43, P.15720-15728.Ivanov I., Kuhn H., Saam J., Holzhutter H.-G. Dual role of oxygen during lipoxygenasereactions. // FEBS J. 2005, V. 272, P.
2523-2535.Romanov S., Wiesner R., Myagkova G., Kuhn H., Ivanov I. Affinity labeling of the rabbit12/15-lipoxygenase using azido derivatives of arachidonic acid. // Biochemistry. 2006, V.45, P. 3554-3562.Here S., Schadendorf T., Ivanov I., Herberger Ch., Steinle W., Rück-Braun K., PreissnerR., Kuhn H. Photoactivation of an inhibitor of the 12/15-lipoxygenase pathway.
//ChemBioChem. 2006, V. 7, P. 1089-1095.Гроза Н.В., Иванов И.В., Голованов А.Б., Мягкова Г.И. Химический синтез гидроксипроизводных растительных жирнокислотных субстратов. // Вестник МИТХТ.2006, T. 1, C. 29-32.Saam J., Ivanov I., Walther M., Holzhütter H.-G., Kuhn H. Molecular dioxygen enters theactive site of 12/15-lipoxygenase via dynamic oxygen access chanels. // Proc.
Natl. Acad.Sci USA. 2007, V. 104, P. 13319-13324.Yu S.-C., Borchert A., Kuhn H., Ivanov I. Synthesis of a new seleninic acid anhydride andmechanistic studies into its glutathione peroxidase activity. // Chemistry Eur. J. 2008, V. 14,P. 7066-7071.Mei G., Di Venere A., Nicolai E., Angelucci C.B., Ivanov I., Sabatucci A., Dainese E., KuhnH., Maccarrone M. Structural Properties of Plant and Mammalian Lipoxygenases.Temperature-dependent conformational alterations and membrane binding ability. //Biochemistry.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
