Автореферат (1090325), страница 7
Текст из файла (страница 7)
1) и подтверждаютучастие аминокислотных остатков поверхности междоменового пространства в процессахсвязывания с биомембранами и, возможно, с липидным субстратом.4.1.3. Структурные изменения фермента при мутациях Тyr98 и Тyr614.Сравнение КД-спектров мутантов по Тyr98 с r12/15-LOX дикого типа не выявилосущественных различий во вторичной структуре белка. Более того, спектры статическойфлуоресценциибылипрактическиидентичными,чтосвидетельствовалоо28незначительном влиянии мутации на третичную структуру.
Природная r12/15-LOX имеетзначение pI 5,5, тогда как для рекомбинантного фермента дикого типа это значениенесколько выше, pI 5,7 (рис. 12Б, вставка). Сходные значения были получены длямутантов Y98F, Y98A и Y614R (рис. 12Б, вставка). В случае мутанта Y98R наряду сосновным сдвигом величины pI требовалась более высокая ионная сила буфера дляэлюирования образца с анионообменной смолы (аналитическая хроматография). Этотрезультат позволил предположить, что введение положительно заряженного Argуменьшает суммарный отрицательный заряд белка, что возможно только в условияхраскрытия междоменового интерфейса (рис.
12А и 12Б). Аналитическая гель-фильтрацияпозволила обнаружить увеличение гидродинамического радиуса (Rh) мутанта Y98R на 2 Å(32,8 Å) по сравнению с величиной Rh, рассчитанной для фермента дикого типа (30,8 Å)(рис. 12В, Таблица 5). Напротив, мутации Y614R, как одного из партнеров ароматическоговзаимодействия между N-концевым и каталитическим доменами оказалось недостаточнодля раскрытия интерфейса, о чемТаблица 5. Сравнительный анализ величинсвидетельствуетотсутствиегидродинамическогорадиусаирадиусавращения фермента дикого типа и мутантовизмененийвеличиныRh.Вкачествеобъяснениягель-фильтрацияданные МРРБелокдоляограниченного эффекта Y614RRh (Å)Rg (Å)мономеров(%)можно предположить образованиеWT30,831,993-катионнноговзаимодействияТyr с Arg , который может бытьполностью протонирован при рНY98R32,88,0.
Величины гидродинамическихY614R+Y98R34,138,573радиусов Rh, рассчитанные наоснове данных гель-фильтрации, хорошо коррелируются с величинами Rg. В то время каккак структура низкого разрешения Y614R, полученная с использованием методамалоуглового рентгеновского рассеяния (МРР) практически не отличается от ферментадикого типа (рис. 12Г), для двойного мутанта (Y614R+Y98R) наблюдается увеличениерадиуса вращения в результате раскрытия интерфейса и/или увеличения доли димернойфракции с 7% (фермент дикого типа) до 27% (Y614R+Y98R мутант) (табл. 5).С целью дальнейшего изучения структурных изменений, связанных с потерейароматического взаимодействия между доменами, было исследовано влияние мутациипо Туr98 на термостабильность фермента.
r12/15-LOX достаточно стабильна в диапазонетемператур до 40°C, однако при более высокой температуре она быстро теряетвторичную структуру. На рисунках 13А и 13Б показано, что температура денатурации (T50),Y614R30,832,78798614при которой белок теряет половину своей вторичной структуры, для рекомбинантнойr12/15-LOX лежит в области 40-45°С в зависимости от рН. Для мутантов по Туr98 былиполучены более сложные кривые денатурации. Подобные расхождения в кинетикеденатурации фермента дикого типа и мутантов при рН 6,8 указывают на различия вовторичной структуре (КД-спектров) последних при температуре 60°C, предполагаянеспецифическую агрегацию в диапазоне высоких температур.
Для количественнойоценкиагрегацииLOXбылоиспользованодинамическоерассеяние29Рис 13. Термостабильность структуры r12/15-LOX и ее мутантов. (A и Б) Величиныинтенсивности сигнала КД 1 мкМ раствора липоксигеназы при 220 нм показана какфункция температуры.
(Б) Динамическое рассеяние света для оценки агрегатногосостояния r12/15-LOX и мутантов при различных pH буфера (20 мМ Tris).света, которое не показало образования высокомолекулярных агрегатов для ферментадикого типа (рис. 13В). Напротив, для мутанта Y98A эффект агрегации был ярко выражен.Хотя r12/15-LOX и Y98R мутант оставались относительно стабильными до 30°C, Y98Aобразовывал более крупные олигомеры при этой температуре (рис. 13В, правая панель).Таким образом, потеря ароматического взаимодействия между каталитическим и Nтерминальным доменами приводит к снижению стабильности белка, увеличениюолигомеризации и, как следствие, изменению функциональных свойств фермента.4.1.4. Роль N-концевого домена в стабилизации подвижной 2 спирали.Помимо N-терминального домена r12/15-LOX содержит еще один подвижный структурныйэлемент – 2 спираль.
В конформации фермента, свободной от лиганда (конформер А;PDB 2P0M), эта спираль состоит из 25 аминокислот (аминокислоты 169-193), тогда как вконформере Б (комплекс с лигандом) 2 теряет часть своей спиральной структуры(аминокислоты 169-176) и подвергается дислокации (~12 Å). Хотя молекулярныемеханизмы подобного конформационного перехода изучены недостаточно, можнопредположить, что именно субстрат играет ключевую роль в этом процессе, так какактивный центр фермента в конформере А просто не способен принять молекулу ПНЖК всубстрат-связывающую полость из-за стерических ограничений. Таким образом,конформационная гибкость 2 спирали и подвижность N-терминального домена поотношению к каталитическому доменумогут быть взаимосвязанными процессами.30Анализкристаллическойструктурысвободного от лиганда конформера Аr12/15-LOX (PDB 2P0M) позволилобнаружить наличие ряда контактовмежду остатками N-концевого домена(Ser13, Ile14, Tyr15) и 2 спирали (Leu168,Glu169, Asp170), которые, за исключениемводороднойсвязимежду170карбоксильнойгруппойAspиамидной NH-группы Ile14 (рис.
11А),имеют в основном гидрофобныйхарактер.Доляповерхности,приходящейся на остатки Ile14 и Asp170,доступна молекулам воды на 60-65%(PISA),чтовсольватированномсостоянииделаетмаловероятнымвкладводородныхсвязейвстабилизацию структуры. С другойстороны, пространственная близостьостатковIle14иAsp170 делаетвозможнымсозданиеболеестабильного солевого мостика путемРис. 14. Термостабильность r12/15-LOX и еенезначительных модификаций белка.I14K мутанта. (A) Величины интенсивностиДля этой цели методом направленногосигнала КД 1 мкМ раствора белка при 220 нмпоказана как функция температуры. (Б)мутагенеза Ile14 был заменен наСравнение КД-спектров при 37 и 53 oCположительно заряженный Lys.
Хотяпредполагаетразличныемеханизмыденатурации r12/15-LOX и ее I14K мутанта прикривые денатурации как ферментаповышенных температурах.дикого типа, так и мутанта I14K (рис.14А) имели идентичное плато в диапазоне температур 47-55°C, мутант I14K, в отличие отфермента дикого типа, продолжал терять свою вторичную структуру до 72 оС. Несмотряна то, что при 9°С КД спектры нативного фермента и мутанта были практическиидентичными (рис.
14А, вставка), различия в их вторичной структуре наблюдались притемпературах 37 и 53°C (рис. 14Б). Анализ вторичной структуры LOX дикого типа и ееI14K мутанта по методу Яанга (37°С) показал, что нативный фермент с долей спиральной структуры 31,4 ± 0,8% теряет ее в большей степени, чем мутант (35,2 ± 0,9%).При этом доля -складчатой структуры белка остается неизменной (13,9 ± 0,1%).
Такимобразом, разница в 3,8 ± 1,7% от общей структуры белка свидетельствует о потере структуры сегмента длиной в 25 аминокислот, что соответствует длине полной 2спирали. Полученные данные позволяют предположить, что повышенная подвижность Nтерминального домена по отношению к каталитическому домену и потеря контактов саминокислотными остатками 2 спирали могут лежать в основе конформационногоперехода этого структурного элемента из состояния конформера А r12/15-LOX всостояние конформера Б.314.1.5.Анализтретичнойструктурыидинамикиконформационныхизменений r12/15-LOX дикого типа и мутантов. Для изучения стабильноститретичной структуры r12/15-LOX и динамики ее конформационных изменений в даннойработе использовали анализ продолжительности эмиссии флуоресценции остатковтриптофанов в зависимости от температуры.
При наличии ряда остатков триптофанов вструктуребелка,эмиссияфлуоресценциихарактеризуетсянепрерывнымРис. 15. Температурная зависимость распределений продолжительности эмиссиифлуоресценции. Короткая (левый график) и длинная (правый график)компоненты распределений продолжительности эмиссии показаны раздельно.Вставка: ширина компоненты на уровне половины максимума распределенияпоказана как функция температуры. (A) Динамическая флуоресценция водногораствора r12/15-LOX (1 мкM) в диапазоне температур от 10 до 52°C. (Б)Динамическая флуоресценция водного раствора Y98R мутанта (1 мкM) вдиапазоне температур от 10 до 52°C. (В) Динамическая флуоресценция водногораствора r12/15-LOX (1 мкM) в диапазоне температур от 10 до 52°C I14K мутанта.распределением продолжительности, которое содержит короткую (1La) и длинную (1Lb)компоненты.
Если вклад компоненты 1Lb в спектры эмиссии незначителен, анализкомпоненты 1Lb позволяет оценить природу гидрофильного и/или гидрофобногоокружения триптофановых остатков. При этом ширина распределения эмиссии отражаетконформационную разнородность третичной структуры, обусловленную структурнымиколебаниями в пределах наносекунды. Анализ продолжительности эмиссиифлуоресценции триптофановых остатков r12/15-LOX показал, что разнородность сигнала32уменьшается от 10°C до 35°С, а затем возрастает с повышением температуры (рис. 15А).Напротив, ширина обеих компонент распределения для мутанта Y98R не изменяласьвплоть до 40°С (рис. 15Б). При 10°С короткая компонента распределения для ферментадикого типа была почти в два раза шире соответствующей компоненты Y98R (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
