Автореферат (1090325), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Изучение структуры r12/15-LOX в растворе.Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапахисследования от теоретического обоснования гипотез и постановки задачи, организации ипланировании проведения ключевых экспериментов до обсуждения и оформленияполученных результатов. Кроме того, автором непосредственно выполнено подавляющееколичество синтетических, молекулярнобиологических, биохимических и аналитическихработ.Апробация работы. Материалы, включенные в диссертацию, докладывались болеечем на 40 всероссийских и международных симпозиумах и конференциях, в том числе наIII съезде Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002); International symposium onrecent biomedical advances in eicosanoid research (Берлин, ФРГ, 2002); XVIIМенделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); 8th Internationalconference on eicosanoids and other bioactive lipids in cancer, inflammation and relateddiseases» (Чикаго, США, 2003); International prestigious research meeting Центрального5технологического университета (Блюмфонтейн, ЮАР, 2006); на ежегодном симпозиумеЕвропейского консорциума в области исследований эйкозаноидов Annual EICOSANOXmeeting 2007 (Айген, Австрия); 10th International conference on bioactive lipids in cancer,inflammation and related diseases (Монреаль, Канада, 2007); на итоговом симпозиумеЕвропейского консорциума в области исследований эйкозаноидов EICOSANOX Meeting2009 в Каролинском институте (Стокгольм, Швеция), на конференциях XVII Lipid meeting(Лейпциг, Германия, 2011) и 14th International conference on bioactive lipids in cancer,inflammation and related diseases (Будапешт, Венгрия, 2015).Публикации.
Основные результаты исследований, полученные при выполнениидиссертации, изложены в 4 обзорах, 22 оригинальных статьях в рецензируемых журналахиз списка ВАК и ряде тезисов докладов российских и международных конференций.Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры ХТБАС при поддержке Федерального агентства по науке и инновациям, проект № МК2503.2003.03 «Разработка новых подходов получения ациклических производныхарахидоновой кислоты с целью изучения механизмов транспорта кислорода в активныйцентр липоксигеназ млекопитающих» (Грант Президента РФ для молодых кандидатовнаук); по проекту РФФИ № 04-03-3245 «Новый подход к синтезу гидроксилированныхполиненасыщенных жирныхкислотнаосновеасимметричныхахиральныхпредшественников»; по проекту Марии Кюри № MIF1-CT-2006-021230 «Молекулярнаяэнзимология ферментов каскада арахидоновой кислоты: от исследований механизмаферментативных реакций к разработке лекарственных препаратов» (программа «IncomingInternational Fellowships»); а также при поддержке исследовательской стипендиинемецкого фонда Александра фон Гумбольдта № RUS-1111557 «Молекулярнаяэнзимологии липоксигеназ».Объем диссертации и ее структура.
Диссертационная работа изложена на 235страницах, содержит 8 схем, 21 таблицу, 51 рисунок. Она состоит из введения,литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части,выводов и списка цитируемой литературы (319 ссылок на литературные источники).ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ1. Химический синтез зондов активного центра липоксигеназ1.1. Полный химический синтез терминальных и субтерминальных замещенныхпроизводных арахидоновой кислотыСоединения, содержащие азидогруппу в своей структуре, являются ценныминструментом при изучении взаимодействия в ряду фермент–лиганд благодаря ихспособности вступать в ковалентное взаимодействие с белком под действиемультрафиолетового облучения.
С целью изучения процессов фермент-субстратногосвязывания r12/15-LOX предложена группа новых синтетических азидосодержащихаффинных маркеров липоксигеназ, которые наиболее близко отображают структуруприродного субстрата – АК, целенаправленно модифицированной в области сигнальныхучастков субстратного связывания (концевой CH3 группы). В основу их синтеза положено6использование природных гидроксилированных по положению метаболитов АК.Наличие ОН-группы в углеводородной цепи молекулы ПНЖК (16-, 17-, 18-, 19-, 20-НЕТЕ)дает возможность получения различных производных, в том числе, азидов, с помощьюнемногочисленных модификаций. Кроме того, -4 гидроксилированные ПНЖК могутиспользоваться для исследования механизмов окислительного метаболизма липидов сучастием других ферментов каскада АК, включая циклооксигеназу и цитохром P-450.Схема 1Большинство ранее предложенных энантиоспецифических методов синтеза гидроксилированных производных АК основаны на принципе олефинирования по Виттигу,который не обеспечивает возможности селективного введения радиоактивной метки,необходимой для проведения биологических исследований, в молекулу ПНЖК.
Внастоящей работе целевые соединения были впервые получены на основе полногохимического синтеза с применением полиацетиленового подхода. Ацетиленовая связьслужит удобным предшественником (Z)-двойной связи, а методы, разработанные вприменении к синтезу природных полиненасыщенных структур и лежащие в основепостроения полиацетиленовой цепи (кросс-сочетание пропаргильных галогенидов сацетиленовыми соединениями), обеспечивают возможность создания системыдвойных связей требуемой конфигурации с одновременным введением функциональныхгруппировок.
Особым преимуществом предложенного метода является возможностьвведения радиоактивной метки на конечных стадиях синтеза, что позволяетминимизировать количество манипуляций с радиоактивно-мечеными соединениями.Ретросинтетический анализ (Схема 1) показывает, что -4 гидроксилированныепроизводные АК могут быть получены в рамках единой синтетической схемы кросссочетанием региоизомеров (бензоилокси)гептина (1), бифункционального производного 7бром-2,5-гептадиин-1-ола (2) и метилового эфира 5-гексиновой кислоты (3) в условияхобразования промежуточных металлоорганических комплексов переходных металлов –Cu (I).
В основу синтеза -3-4 гидроксикислот, для которых в рамках поставленныхзадач существовала необходимость выхода на оптически активные изомеры, положеноиспользование как исходных соединений с заданной конфигурацией асимметрическогоцентра, так и принципа препаративного разделения конечных рацемических продуктов наоптически активные изомеры.71.1.1.
Синтез региоизомерных по положению гидроксигруппы терминальныхацетиленов (1). rac-3-(Бензоилокси)гепт-1-ин (1a), ключевой синтон в cинтезе rac-16НЕТЕ и ее производных был получен алкилированием коммерчески доступногопентаналя (4) литиевым производным этинилтриметилсилана (5) с последующей защитойгидроксильной группы и удалением триметилсилильной защиты.
(R)-4-(Бензоилокси)гепт1-ин (1b) был получен исходя из (S)-эпихлоргидрина (7) (Схема 2). Раскрытиеоксиранового цикла по методу Ямагучи приводило к образованию (S)-1-хлор-5-(триметилСхема 2Условия: (a) TMSC≡CH (5), n-BuLi, ТГФ, -78oC, 0,5 ч; (b) BzCl, Py, бензол, 20oC, 10 ч; (c) nBu4NF, THF, 20oC, 2 ч; (d) TMSC≡CH (5), n-BuLi, BF3·Et2O, TГФ, -78oC, 40 мин; (e) NaI, ацетон,65oC, 48 ч; (f) CuI, EtMgBr, TГФ-HMPA, от -78oC до -50oC; (g) NaI, ацетон, 75oC, 15 ч; (h)TMSC≡CH (5), n-BuLi, HMPA, -20oC, 5 ч; (i) (COCl)2, CuI, MeLi, Et2O, -78oC (j) LiAlH4, TГФ, от 20oC до 0oC.силил)пент-4-ин-2-ола (8). Замещение хлора на йод и удлинение цепи с использованиемEt2CuMgBr, а также последующая защита гидроксильных групп и удалениетриметилсилильной группы приводило к соединению 1b c общим выходом 42%. rac-3(Бензоилокси)гепт-6-ин (1с), ключевое соединение в синтезе rac-18-НЕТЕ (44а), получен собщим выходом 53% исходя из rac-1-хлорпентан-3-ола (10), который в свою очередьполучали восстановлением коммерчески доступного 1-хлор-3-пентанона действиемNaBH4.
Замещенный гептин 1d был синтезирован исходя из 6-(триметилсилил)гекс-5иновой кислоты (13) сочетанием ее хлорангидрида с диметилкупратом лития при -78oC пометоду Познера и восстановлением карбонильной группы LiAlH4 с общим выходом 56%.1-(Бензоилокси)гепт-6-ин (1е) получали из 6-гептиновой кислоты (16) (Схема 2).81.1.2.
Синтез -4-3 замещенных оптически активных производныхарахидоновой кислоты. В основе синтеза rac-16-HETE (Схема 3) и 17(R)-HETE (Схема4) лежит использование впервые полученных тетраацетиленов 19 и 29 в качествепромежуточных соединений.Схема 3Условия: (a) CBr4, PPh3, CH2Cl2; (b) 3, CuI, NaI, K2CO3, ДМФ, 20oC; (c) H2 и обращено-фазоваяВЭЖХ; (d) NaOMe, MeOH, 20oC и ВЭЖХ на хиральной фазе; (e) Me2NSF3, CH2Cl2, -78oC; (f)NaOH, MeOH–H2O, 20oC; (g) LiOH, MeOH–H2O, 20oC; (h) 3H2/ катализатор Линдлара, бензол,10oC.Триацетиленовые бромиды 18 и 28 были получены через соответствующие спирты 17 и27 кросс-сочетанием ключевого синтона 2 с терминальными ацетиленами 1а и 1b.Последующее сочетание метилового эфира 5-гексиновой кислоты (3) с бромидами 18 и28 приводило к образованию эфиров rac-16-(бензоилокси)эйкоза-5,8,11,14-тетраиновой(19) и 17(R)-(бензоилокси)эйкоза-5,8,11,14-тетраиновой (29) кислот, соответственно.Анализ продуктов стереоселективного гидрирования эфиров 19 и 29 на катализатореЛиндлара в бензоле в присутствии хинолина (соотношение субстрат/катализатор 1:1, помассе) методом обращенно-фазовой ВЭЖХ показал образование основного и побочногопродуктов гидрирования 20 и 24 в соотношении 3:1, а также 31 и 32 в соотношении 2:1.
Вслучае, когда соотношение субстрат/катализатор изменяли в сторону уменьшенияколичества катализатора (соотношение 3:1, по массе) наблюдался сдвиг равновесия всторону образования побочного продукта 24 (соотношение 20:24=1:1). При увеличенииколичества катализатора (соотношение 1:2, по массе), напротив, сдвиг происходил всторону образования основного продукта 20 и наблюдалось практически селективноеобразование соединения 31. Анализ масс-спектров, а также исследования в области ЯМРпоказали наличие тройной связи в структуре соединений 26 и 34а, свидетельствуя о том,что образование побочного продукта происходит вследствие неполного каталитического9Схема 4Условия: (a) 3, CuI, NaI, K2CO3, DMF, 20oC; (b) H2 или 3H2, катализатор Линдлара и обращенофазовая ВЭЖХ; (c) NaOH, MeOH-H2O, 20oC; (d)TsCl, CH2Cl2, Py, 20oC, 24 ч; (e) NaN3, ДМФ, 85-95oC, 2.5 ч; (f) H , катализатор Линдлара, бензол, 10oC; (g) 3H , катализатор Линдлара, бензол,2210oC; (h) H2, катализатор Линдлара, MeOH, i) NaOMe, MeOH, 20oC; j) PPh3, BzOH, TГФгидрирования субстрата из-за пространственных затруднений, создаваемых объемнымостатком бензойной кислоты при C-16 и С-17 атомах углерода в области C14-С15 тройнойсвязи.
Соединение 24 было идентифицировано как rac-(5Z,8Z,11Z)-16-гидроксиэйкоза5,8,11-триен-14-иновая кислота, о чем свидетельствует наличие характерного сигналатриплет-триплетов H=5,55 м.д. в спектре 1Н-ЯМР, который является результатомразвязки C-16 протона на атомах водорода соседней 17-СН2 группы (J = 6,4 Гц) иметиленовых протонов при С-13 (J = 1,7 Гц). На основе масс-спектральных данных испектров двумерной гетероядерой 1H/13C корреляции (HMBC) (рис. 1) соединение 32абыло идентифицировано как метиловый эфир (R,5Z,8Z,11Z)-17-(бензоилокси)эйкоза5,8,11-триен-14-иновой кислоты. При анализе спектральных данных наблюдалась10Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
