Автореферат (1090325), страница 3
Текст из файла (страница 3)
1. ЯМР-спектр двумерной гетероядерной 1H/13C корреляции соединения32.однозначная корреляция между ближними(C-15/H2-16) и удаленными атомами (C-15/H17, C-15/H2-13). Кроме того, наличие трехперекрестныхсигналовуказывалонадополнительную корреляцию в ряду: C14/H2-13, C-14/H-12 и C-14/H2-16.Кислота [3Н8]-17(R)-HETE (30), меченаятритием по четырем двойным связям2, былавпервыеполученакаталитическимгидрированиемсоединения29с3использованиемН2накатализатореЛиндлара в бензоле с высокой удельнойактивностью(175-180Ки/ммоль)ирадиохимической чистотой более 98%. Вслучае предшественника rac-(16)-HETE (18)введение метки по всем тройным связям неприменялосьиз-занеобходимостиприменения ВЭЖХ для отделения побочногопродукта 24, а так же дальнейшегохроматографического разделения рацематаРис.
2. Разделение энантиомеров мети- на оптически активные соединения 21a,b иловых эфиров rac-16-НЕТЕ (21) и ее 25a,b. Энантиомероы метиловых эфиров 16моноацетиленового предшественника (25)с использованием колонки Chiralpack AD в НЕТЕ (21) и его 14,15-дегидроаналога 25системе растворителей: н-гексан/метанол получалиразделениемрацемических(98:2; по объему).смесей с использованием хирально-фазовойВЭЖХ (рис. 2). Масштабирование хроматографической методики позволяло выделитьоптически чистые энантиомеры 16-НЕТЕ (оптическая чистота >99%) в количественескольких десятков миллиграмм. Конфигурацию асимметрической ОН-группыподтверждали измерением угла оптического вращения с последующим сравнениемэкспериментальных данных с литературными.
Для определения конфигурациихирального центра в соединениях 25а и 25b использовали гидрирование энантиомеров всоответствующие тетраеноаты, идентичные соединениям 21а и 21b. 17(S)-НЕТЕ (33b) иее моноацетиленовый аналог (34b) получали на основе (R)-энантиомера инверсиейхирального центра с использованием реакции Мицунобу.В силу того, что высокая удельная радиоактивность [5,6,8,9,11,12,14,15-3H8]-17(R)НЕТЕ (30), необходимая для ряда биологических исследований, затрудняет ееиспользование при проведении дальнейших модификаций в препаративном масштабе,14,15-дегидро-16- (26) и 14,15-дегидро-17-НЕТЕ (34) были выбраны в качествепредшественников азидов. Введение азидогруппы проводили через соответствующие птолуолсульфонаты, что приводило к инверсии хирального центра.
Синтез через бромидысохранял исходную конфигурацию асимметрического центра исходного и конечного2Введениерадиоактивной метки проводили в Институте молекулярной генетики РАН.11продукта, однако замещение бромида на азид происходило не полностью. Важноотметить, что каталитическое восстановление тройной связи в азидах 38 на катализатореЛиндлара в сухом бензоле не затрагивало азидогруппу, тогда как использованиеметанола приводило к восстановлению азида в амин. Кислоты [14,15-3Н]-17-N3-ЕТЕ (39а и39b) были получены с высокой удельной активностью ~40 Ки/моль и по своим свойствамидентичны немеченым производным 36а и 36b.
Использование энантиомеров 16-НЕТЕ(21) и их 14,15-дегидроаналогов (25) в рамках предложенной схемы приводило кобразованию лишь следовых количеств целевых продуктов вследствие низкойстабильности и высокой реакционной способности аллильных и пропаргильных азидов.1.1.3. Синтез терминальных и 2 субтерминальных замещенныхпроизводных арахидоновой кислоты. В основу синтеза новых азидопроизводных 46 иих меченых тритием аналогов 47 положена методология, разработанная для соединений22 и 33 (Схемы 3 и 4). rac-(5Z,8Z,11Z,14Z)-19- (44b) и rac-(5Z,8Z,11Z,14Z)-18- гидроксиСхема 5Условия: (a) CBr4, PPh3, CH2Cl2, 20oC, 1 ч; (b) 8, CuI, NaI, K2CO3, ДМФ, 20oC; (c) H2 /3H2катализатор Линдлара, бензол, 10oC; (d) NaOH, MeOH-H2O, 20oC; (e)TsCl, CH2Cl2, Py,20oC, 24 ч; (f) NaN3, ДМФ, 75-80 oC, 3.5 ч-5,8,11,14-эйкозатетраеновые (44а) кислоты использовались в качестве ключевыхпромежуточныхсоединений(Схема5).(5Z,8Z,11Z,14Z)-20-гидрокси-5,8,11,14эйкозатетраеновая кислота (44с) была использована в работе без дальнейшихмодификаций.
Из соображений безопасности введение азидогруппы в молекулурадиоактивно-меченых гидроксикислот 45 [радиохимическая чистота >95% и удельнаярадиоактивность в 160 Ки/моль] проводилось с использованием образцов разбавленныхнемечеными аналогами 44 в соотношении 1:100. Конечные продукты 47 были получены свыходом ~26% по 2-м стадиям с удельной радиоактивностью в интервале 0,79 - 1,612Ки/моль. Идентичность радиоактивно-меченых соединений 47 их немеченым аналогам 46показана с помощью аналитической ВЭЖХ.1.2. Синтез зондов активного центра на основе ингибиторов r12/15-LOXИспользованиеингибиторовявляетсяраспространеннымподходомприисследовании каталитического центра фермента, связывающих доменов регуляторныхбелков и пр. С целью изучения механизмов взаимодействия в ряду r12/15-LOX–лигандбыли получены новые соединения 48-52, дизайн которых основан на сходстве сРис. 3.
Структуры ингибиторов r12/15-LOХизвестными ингибиторами 5-LOX и r12/15-LOX (рис. 3), таких как целутон (53), эбселен(54) и салициловая кислота (55). (Z)-Изомер метилового эфира 2-бензилиден-3-оксо-2,3дигидробензо[b]тиофен-7-карбоновой кислоты (BODTCM) (48а)3 получали реакциейтиондоксила (56) с бензальдегидом (57) (Схема 6). Облучение раствора (Z)-BODTCM вДМСО при 405 нм приводило к изомеризации двойной связи с образованиемфотостационарной смеси (pss). Определения количественного соотношения Z- и Eизомеров в смеси pss (Z:E=38:62) проводили с помощью 1Н-ЯМР-спектроскопиисравнением интенсивности сигналов винильных протонов с химическим сдвигом =7,96 и=7,73 м.д. для Z- и E- изомеров, соответственно.
(Е)-BODTCM (48b) выделялиразделением смеси pss препаративной ВЭЖХ. УФ-спектры каждого из изомеров 48а и48b характеризовались наличием двух максимумов поглощения при 320 и 436 нм, и 320 и455 нм, соответственно.Схема 6Условия: (a) бензальдегид (57), 4М HCl в диоксане, 20oC; (b) MeOH, 70oC, 1,5ч; (c) облучение при 405 нм.3Выполненосовместно с Институтом химии Технического университета г.
Берлин, Германия.13Соединения, содержащие связи типа Se-N, Se-O, помимо связывания с активнымцентром фермента (прямое ингибирующее действие), обладают также редокспотенциалом и, следовательно, могут оказывать непосредственное воздействие настепень окисления каталитического железа,Схема 7восстанавливая фермент в его неактивнуюFe2+-форму. С целью создания новыхпотенциальныхселеносодержащихингибиторовLOX,обладающихвосстанавливающими свойствами, предложенсинтез 5-селенопроизводных салициловойкислоты49-52сиспользованиемтетрахлорида селена (Схема 7). Водныйгидролиз промежуточных 5-арилтрихлоридовселена, полученных в мягких условияхприводил к образованию 5-арилпроизводныхселенистой кислоты (50c-e) и/или ангидридов(49a-b). Следует отметить, что только вслучае,когдамонозамещенныеамидысалициловойкислоты(55)содержали(a) SeCl4, TГФ, 20oC, 1 ч; (b)свободную карбоксильную группу, в реакции Условия:oH2О, 20 C, 24ч; (c) SeCl4, TГФ, 70oC, 1 ч.образовывались соответствующие ангидриды49a-b (Схема 7).
Эти данные свидетельствовали о возможности протекания такназываемой спонтанной этерификации в присутствии заместителя, содержащегосвободную карбоксильную группу, что косвенно подтверждалось данными массспектрометрии высокого разрешения соединения 50e, для которого массовое число (m/z264,96031), соответствующее молекулярному иону метилового эфира, было получено прииспользовании метанола в качестве растворителя. В более жестких условиях прикипячении в ТГФ промежуточные 5-трихлорселенильные производные салициловойкислоты разлагались с образованием смеси так называемых «желтого» диселенида 51 и«белого» моноселенида 52, которые разделяли с помощью флеш-хроматографии.
Всесоединения были выделены в кристаллическом виде, охарактеризованы спектральнымиданными, включая 77Se-ЯМР, физико-химическими константами и даннымирентгеноструктурного анализа (для соединений 50c-e).2. Изучение взаимодействия r12/15-LOX с лигандом2.1. Исследования r12/15-LOX с использованием аналогов их природных субстратов2.2.1. Введение фотоаффинной метки в r12/15-LOX. В основу разработаннойстратегииисследованияструктурныхэлементовфермента,непосредственновзаимодействующих с молекулой ПНЖК, положен принцип подобия структур природногосубстрата LOX – АК и синтезированных азидо-ETE. Кинетический анализ параметровокисления фотоаффинных зондов 36 и 46a-b показал, что параметры окисления5Выполненов Институте биохимии Медицинского университета Charité, г.
Берлин, Германия14Рис. 4. Введение фотоаффинной метки в r12/15-LOX с использованием азидопроизводных АК. (А) Кривые окисления фотоаффинных зондов под действием r12/15LOX; (Б) Анализ продуктов окисления 19-азидо-ETE методом ВЭЖХ; (В) Введениефотоаффинной метки в r12/15-LOX на основе [3H8]-19-азидо-ETE (47b); (Г) ВЭЖХ анализ19-азидо-ETE; (Д) Хроматограмма пептидов протеолитического расщепления меченойr12/15-LOX под действием трипсина; (Е) Распределение радиоактивности по фракциям.19-азидо-ETE (46b), КМ* 10,9 мкМ и kcat 20 с-1, наиболее близко сопоставимы схарактеристиками, полученными для АК (рис. 4А)6.
Анализ ВЭЖХ продуктов окислениясоединения 46b позволил обнаружить образование основного продукта с максимумом6Вработе использовались природная r12/15LOX, выделенная из клеточной суспензии кровикролика, обогащенной ретикулоцитами (Rapoport S.M. et al. J. Biochem.
1979, V. 96, P. 545–561), атакже рекомбинантные препараты (фермент дикого типа r12/15LOX и мутанты). Рекомбинантныепрепараты, содержащие 6-His ТАГ, получали экспрессией фермента в Escherichia coli,обогащением ферментных фракций на смоле Ni-NTA (Quiagen) с последующей очисткой методомжидкостной экспресс-хроматографии белков (FPLC) на анионно-обменных смолах и гельфильтрацией.
Чистота полученных препаратов составляла >98%.15поглощения при 235 нм (рис. 4Б), характерным для сопряженного диенового хромофора с(Z,E)-конфигурацией. Присутствие незначительных количеств побочного продукта современем удерживания 9,9 мин и максимумом поглощения при 231 нмсвидетельствовало о наличии (Е,Е)-геометрии двойных связей в его структуре.
Хотя, вслучае 17-азидо-ЕТЕ (36) и 18-азидо-ETE (46а) основная доля продуктов окисления исодержала ОН-группу при C-15, наличие ряда побочных изомерных продуктовсвидетельствовало о более низкой степени субстратной специфичности реакции. Такимобразом, на основе высокого субстратного сходства с АК 19-азидо-ETE и ее меченныйтритием аналог (46b и 47b) были выбраны в качестве зонда для введения фотоаффиннойметки. В целях оптимизации процесса (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
