Автореферат (1090325), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Глобальныйминимум свободной энергии (-19,8 кДж/моль) находится непосредственно напротивакцептора водорода (Fe3+-OH) предполагая, что концентрация O2 в области активногоцентра (желтый пунктир) в ~100 раз превышает соответствующую концентрацию вэквивалентном объеме растворителя (1Å3).
Использование алгоритма ступенчатогозатопления энергетического «ландшафта» позволило реконструировать области сминимальной энергией и выделить три основных пути, соединяющие поверхность белка собластью высокого сродства к O2 в активном центре (рис. 9Б). Канал 1,характеризующийся самым низким барьером, начинается в нижней части субстратсвязывающего кармана и достигает поверхности белка в области аминокислотныхостатков Leu408 и Ile414. Второй канал представляет собой саму полость субстратсвязывающего кармана. В отсутствии липидного субстрата этот канал являетсясвободным от каких-либо энергитических и стерических ограничений для проникновенияРис 9.
Свободное распределение энергии для определения вероятности нахождениякислорода в r12/15-LOX кролика. (А) Наложение четырех изоповерхностей свободнойэнергии с уровнями энергии -12.1, -9.5, -7.0 и -3.0 кДж/моль (от темно к светлофиолетовому). (Б) Оптимальные маршруты транспорта кислорода в молекуле r12/15-LOX(молекула АК показана с целью улучшения ориентации).
(B) Оптимальные маршрутытранспорта кислорода в комплексе r12/15-LOX с АК. (Г) Энергетическиий профиль каналов3 и 4.O2. Третий канал соединяется с активным центром с противоположной стороны белковоймолекулы. Его энергетический профиль характеризуется наличием двух барьеров вобласти боковой цепи Lеu367. В отличие от полости субстрат-связывающего кармана,канал 3 представляет собой отдельные, преимущественно гидрофобные полости,непостоянно связанные друг с другом в результате конформационной подвижностиостатков окружающих их аминокислот. Когда субстрат (АК) присутствует в модели (рис.9В), изменений в области высокого сродства к кислороду, а также местоположенииглобального минимума энергии не происходит.
При этом узкий вход субстратсвязывающего канала закрывается, препятствуя проникновению кислорода. Канал 1также исчезает. Однако, открывается четвертый канал, соединяющий активный центр с24поверхностью белка между Trp145 и His426. Тот факт, что область максимальнойконцентрации кислорода и каталитический комплекс Fe3+-ОН расположены по разныестороны молекулы АК, согласуется с антароповерхностным характером липоксигеназнойреакции, при котором отщепление водорода и введение кислорода происходит спротивоположных сторон молекулы ПНЖК. Более того, вероятность нахождениякислорода в радиусе 2Å от С-15 атома АК в 7 раз выше, чем в области C-11, предполагаяпреимущественное окисление по С-15.
Канал 3 являлся функциональным как в случаефермента, не содержащего лиганд, так и его комплекса с субстратом. С цельюэкспериментального подтверждения функциональной роли канала 3 были предпринятыпопытки изменить его проводимость путем направленного мутагенеза. Для этой целиаминокислоту Leu367, находящуюся в области энергетических барьеров, замещали нааминокислоты, несущие объемные (L367F и L367W), а также заряженные (L367K и L367E)боковые заместители. Для оценки влияния точечных мутаций на кислородную провоТаблица 4. Ферментативные характеристики мутантов r12/15-LOX.ферментkcat (с-1)kcat/KM*(S)kcat/KM*(О2)KM(О2)дикий типL367KL367EL367FL367W13,7±0,40,3±0,012,2±0,25,6±0,44,4±0,2(с мкМ)-1(мкМ)(с мкМ)-10,74±0,080,08±0,010,26±0,060,73±0,070,48±0,055,2±2,49,0±1,89,0±2,140,1±3,87,0±3,22,63±1,220,03±0,010,24±0,060,14±0,020,63±0,29димость канала 3 были определены величины kcat и КМ*(O2) (табл.
4) и рассчитанызначения kcat/KM*(O2), определяющие влияние мутации на диффузию кислорода. МутацияL367K вызывала значительное уменьшение kcat и была исключена из дальнейшегорассмотрения. Для мутантов L367F, L367E и L367W, каталитическая эффективностьнаходилась на уровне величины, полученной для фермента дикого типа, но отношениеkcat/KM*(O2) существенно снижалось. Наибольшие изменения наблюдались для L367F, длякоторого величина kcat/KM*(O2) уменьшалась более чем в 20 раз, тогда как KM*(O2)возрастала в 10 раз по сравнению с величиной KM*(O2) фермента дикого типа.Рис. 10. Влияние природы аминокислотного остатка в области энергетическогобарьера (Leu367) на транспорт кислорода в молекуле r12/15-LOX.
(А) фермент дикоготипа, (Б) мутант L367F.25С механистической точки зрения воздействие Phe367 на проводимость канала 3можно объяснить исходя из динамики флуктуаций белковой матрицы и распределениясвободной энергии. В случае мутанта наблюдалось частичное перекрытие канала за счетнескольких кластеров молекул воды в непосредственной близости от Phe367. Для мутантаL367F (рис. 10Б) молекулы воды W1 и W2 были иммобилизованны, образуя стабильнуюсеть, которая включает водородные связи с Glu370 и Arg405. Несмотря на то, что остатокLeu367 способен вращаться более или менее свободно, конформация Phe367 неизменялась в процессе моделирования.
Для фермента дикого типа, напротив, водныекластеры не привязаны к определенному сайту гидратации (рис. 10А). Таким образом,результаты экспериментальных и теоретических исследований дают возможностьпредположить наличие механизмов строго контролируемого транспорта кислорода вмолекуле r12/15-LOX через динамические полости, соединяющие участки поверхностибелка с областью каталитического центра Fe3+-OH.4. Изучение пространственной структуры r12/15-LOX в растворе4.1. Вклад контактов между N-терминальным и каталитическим доменами r12/15LOX в стабильность вторичной и третичной структур белка94.1.1.
Анализ характера взаимодействия N-концевого и каталитическогодоменов. Молекула r12/15-LOX представляет собой единую полипептидную цепь,организованную в виде двухдоменной структуры. Хотя в кристалле оба домена тесносвязаны друг с другом, в растворе N-терминальный домен обладает достаточно большойстепенью подвижности относительно каталитического домена. Использование программыPISA(www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/cgi-bin/piserver)позволилоболеедетальноохарактеризовать взаимодействие между двумя доменами в r12/15-LOX (PDB 2P0M),разделяющих совместную площадь контакта в 777 A2.
Несмотря на то, что 805 А2приходится на каталитический домен (21 аминокислота) и 749 A2 на N-концевой домен (23аминокислоты), было выявлено лишь незначительное число аминокислотных остатков,которые участвуют в их непосредственном контакте (рис. 18Б). На этом фоне можновыделить Tyr98, вклад которого составляет ~10% в общую среднюю величину поверхностиконтакта.
Кроме гидрофобных и ван-дер-Ваальсовых взаимодействий, ароматическоекольцо Tyr98 может вступать в электронное взаимодействия с Тyr614 каталитическогодомена (рис. 11А). В кристаллической структуре(PDB 2P0M, конформер А)ароматические кольца обоих тирозинов находятся на расстоянии ~4,1 Å2 (~3,7 Å2 в PDB2P0M, конформер Б), что в случае подвижности N-терминального домена можетприводить не только к Т-образному, но и параллельному взаимодействию этих двухостатков. Анализ гомологии аминокислотной последовательности показывает, что Тyr98(нумерация r12/15-LOX) инвариантен во всех липоксигеназах млекопитающих, в то времякак Тyr614 сохраняется только в 12/15-LOX, а в других изоферментах присутствует в видеароматического His (рис.
11В). Эти данные позволяют сделать вывод о том, что как ,9Выполненов Институте биохимии Медицинского университета Charité, г. Берлин совместно скафедрой экспериментальной медицины и биохимии Университета Tor Vergata, г. Рим, Италия26Рис. 11. Вклад Тyr98 в междоменное взаимодействие в r12/15-LOX. (A)Аминокислотные остатки, вовлеченные в нековалентное взаимодействие доменовr12/15-LOX (2P0M). (Б) Водородные связи между N-терминальным и каталитическимдоменами согласно PISA.
(В) Анализ аминокислотной последовательности игомология липоксигеназ позвоночных.так и -катионное взаимодействие между структурными доменами может представлятьсобой общую черту всех изоформ LOX млекопитающих.4.1.2. Функциональная роль Тyr98 N-терминального домена. С целью изученияфункциональной роли ароматического аминокислотного остатка в положении 98 Тyr98заменяли генно-инженерными методами на Phe, который сохраняет ароматическийхарактер боковой цепи, но не способен образовывать водородные мостики скаталитическим доменом (рис. 11Б), а также нейтральный Ala и положительнозаряженный Arg. Исследование ферментативных характеристик мутантов (рис.12А)показало, что отсутствие ОН-группы в аминокислотном остатке даже слегка повышаетактивность фермента (мутант Y98F).
Это позволяет предположить несущественную рольводородной связи в междоменном взаимодействии. С другой стороны, наличиенейтрального или заряженного остатков приводило к существенному снижениюкаталитической активности. Наиболее значительное понижение активности наблюдалосьв случае Y98R мутанта. В силу сильного ингибирования в области концентраций27Рис 12. (А) Кинетические кривые зависимости скорости ферментативной реакцииr12/15-LOX и мутантов. (Б) Хроматография фермента дикого типа и мутантов наанионобменной колонке Resource Q (6 мл); вставка: изоэлектрическоефокусирование. (В) Аналитическая гель-фильтрация рекомбинантных белков;вставка: определение гидродинамического радиуса (Rh) молекул белка.
ВеличиныKav были рассчитаны на основе уравнения Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo), где Ve объемрастворителя требуемый для элюирования белка, Vo мертвый объем колонки и Vtобщий обьем колонки. (Г) Сопоставление кристаллической структуры мономераr12/15-LOX со структурами низкого разрешения фермента дикого типа и мутантов врастворе, полученных с использованием метода МРР.субстрата >10 мкМ кинетика окисления ЛК под действием Y98R не описываласьуравнением Михаэлиса-Ментена, при этом специфичность образования продуктовокисления оставалась не измененной. Мутация Y98R также понижала способностьфермента к мембранному связыванию; в отличие от фермента дикого типа, 50% белкамутанта оставалось в цитозоле. Эти данные хорошо согласуются с результатами,полученными при введении аффинной метки (раздел 2.1.1, Табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
