Автореферат (1090325), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Определение концентрации ингибитора, при которой r12/15-LOX теряет 50%своей активности (IC50) показало, что среди селенопроизводных салициловой кислоты 4952 только диселениды 49а и 51 обладали способностью ингибировать r12/15-LOX (IC50 8,6и 5,4 мМ, соответственно). При этом моноселениды 49 обладали более высокимсродством к 5-LOX человека и наивысшей активностью по восстановлению Fe3+.
Впротивоположность соединениям 49а и 51 Z-BODTCM (48а) обладал способностьюингибировать r12/15-LOX (IC50 0,7 мМ), сравнимой с эбселеном (IC50 0,6 мМ). Напротив, вслучае E-изомера (48b) величина IC50 составляла лишь 21 мкМ, свидетельствуя о том, чтоактивность Е-изомера при ингибировании r12/15-LOX превышает активность Z-изомера в33 раза. Использование изомеров BODTCM в клеточных системах (трансфицированныеr12/15-LOX моноциты человека) также показалопреимущественное ингибирование фермента Еизомером (48b), хотя различия между активностьюизомеров были менее выраженными.
На основерезультатов структурного моделирования былопоказано, что E-изомер идеально вписывается всубстрат-связывающий карман фермента в областиего основания (Leu597) (рис. 7), а для Z-изомерасуществуютстерическиеограничения.ЭтоподтверждаетранееполученныерезультатыРис 7. Структурная модель(раздел 2.2.1), которые предполагают, что остатоккомплекса изомеров BODTCM сr12/15-LOX.Leu597можетигратьрольдополнительнойдетерминанты, ограничивающей размеры субстрат-связывающей полости фермента.3. Роль кислорода в реакциях с участием липоксигеназ3.1. Бифазный характер скорости окисления 19-НЕТЕ под действием r12/15-LOXКинетика окисления АК r12/15-LOX характеризуется наличием короткой лаг-фазы,которую связывают с окислением восстановленной Fe2+-формы LOX (пероксидазная19Рис.
8. Кинетика окисления 19-НЕТЕ в различных условиях. Экспериментальныекривые (пунктирные линии), данные кинетического моделирования (сплошные линии).Условия: (А) 100 мкM 19-НЕТЕ, 280 мкM О2; (Б) 200 мкM 19-НЕТЕ, 87 нM фермент, 1мкM 13(S)-HpODE; (В) 200 мкM 19-НЕТЕ, 280 мкM О2, 1 µM 13(S)-HpODE; (Г) 87 нMфермент, 280 мкM О2, 1 мкM 13(S)-HpODE; (Д) 200 мкM 19-НЕТЕ, 280 мкM О2, 87 нM.форма) в каталитически активное состояние (Fe3+). Кинетика окисления 20-НЕТЕ (44с) исуб-терминальной 19-НЕТЕ (44b) в отсутствии экзогенного активатора (13(S)-HpODE)характеризовалась наличием чрезвычайно длинной лаг-фазы (~15 мин) и короткойпрогрессивной фазы, за которой следовала фаза обратимой инактивации фермента (рис.8А).
Наличие фазы обратимой инактивации свидетельствовала об образовании менееустойчивого фермент-субстратного комплекса, чем в том случае, когда АКиспользовалась в качестве субстрата. С целью выявления причин подобной кинетическойзависимости были проведены исследования скорости ферментативной реакции вкачестве функции от концентрации субстрата, кислорода, фермента, а также активатора20(13(S)-HpODE). В качестве субстрата была выбрана rac-19-НЕТЕ (44b), для которойэффект был наиболее ярко выраженным. Независимо от исходных условий (рис.
8Б - 8Д)кинетические кривые окисления 19-НЕТЕ имели нелинейный характер и практическиодинаковую форму. Хотя только прогрессивная фаза скорости окисления 19-НЕТЕ (рис.8А) может быть описана уравнением Михаэлиса-Ментена, оценочное значение величиныКМ* субстрата в 90 мкМ (гипоксические условия) подтверждало ранее полученные данныео том, что наличие -4 гидроксильной группы независимо от ее положения понижаетсродство фермента к ПНЖК. Интересно отметить, что в случае второго липоксигеназногосубстрата, кислорода, даже при его концентрации в 800 мкМ, насыщения ненаблюдалось. В случае 19-НЕТЕ КМ(О2) превосходила более чем в 40 раз имеющеесязначения КМ(О2) для комплекса фермента с АК (10-20 мкм).
При более высокойконцентрации активатора (13(S)-HрODE) сродство фермент-субстратного комплекса ккислороду возрастало (рис. 8Д), при этом увеличение концентрации кислорода ослаблялодействие 13(S)-HрODE (рис. 8Б). Уменьшение скорости ферментативной реакции вусловиях нелимитирующих концентраций субстратов (ПНЖК и кислород) предполагает,что экзогенный активатор (13(S)-HpODE) может подвергаться ферментативномупревращению под действием пероксидазной активности Fe2+-LOX.
Действительно, болеечем через две минуты после начала реакции ~90% активатора превращалось вкетодиеновое производное. Полученные данные показывают, что концентрацияактиватора постепенно снижается в процессе протекания реакции, при этом постоянноепонижение концентрации 13(S)-HpODE и уменьшение ферментативной активностисопутствуют друг другу.3.2.
Кинетическое моделирование и оценка кинетических параметровВ свете экспериментальных данных, изложенных нами, существующая кинетическаямодель липоксигеназного катализа была дополнена и расширена с учетом рядаэлементарных реакций (Схема 8): 1) Активация каталитически неактивной Fe2+-LOXзависит от концентрации кислорода и включает в себя образование кетодиенов исупероксид анионов. Первым шагом перекисной активации LOX является гомолитическоерасщепление пероксидной связи, которое сопровождается переносом электронов от Fe2+LOX к гидроксильному радикалу, приводя к образованию алкоксильного радикала и ОН-.Алкоксильный радикал может восстанавливать кислород с формированием супероксидаи кетодиеновой кислоты (R=O). Кроме того, алкоксильный радикал может бытьстабилизирован посредством бета-расщепления углеводородной цепи, эпоксидированияили димеризации.
2) В случае, когда каталитически активная Fe3+-LOX катализируетотщеплениеводорода,образуетсясубстрат-ферментныйкомплекс2+(EFe -S•).2+Введение молекулярного кислорода в (EFe -S•) приводит к образованию радикального2+комплекса (EFe -SОО•). Оба каталитических интермедиата содержат фермент в2+каталитически неактивной форме EFe , распад которых может привести к выходуфермента из каталитического цикла, что, как следствие, требует его дополнительной2+реактивации. Выход формы EFeиз окислительного цикла сопровождаетсявысвобождением радикальных интермедиатов (S• или SОО•).
Хотя причины выходафермента из окислительного цикла неясны, наиболее вероятно это связано с природой21Схема 8субстрата и/или неустойчивостью фермент-субстратного комплекса. 3) Рекомбинациярадикалов в активном центре. Супероксид (О2•), образующийся при активации2+фермента может рекомбинировать с EFe -S•. Численные значения констант скорости иобязательные параметры были получены путем валидации кинетической модели наоснове экспериментальных данных. Расчетные значения параметров приведены вТаблица 3. Параметры кинетической модели.ПараметрымоделиЗначение2+k+AВеличина3+активация фермента (EFe →EFe )AOOH (13(S)-HpODE)3+12,80±0,97 с-1мкM-12+инактивация фермента (EFe →EFe )AO• (из 13(S)-HpODE)2+3+активация фермента (EFe →EFe )SOOH (15-гидроперокси-19-НЕТЕ)3+2+инактивация фермента (EFe →EFe )SO• (из 15-гидроперокси-19-HETE)122,20±12,20 с-1мкM-1khотщепление водорода10,10±0,50 с-1kOвведение кислорода1,60±0,08 с-1мкM-1kPOобразование продукта (перенос электрона)28,30±2,80 с-1k*POраспад комплекса EFe -SOO•kPSраспад комплекса EFe -S•k-Ak+Pk-Pk*PSkrk*rKSMKPMKAM7,00±0,40 с-1мкM-18,50±0,80 с-1мкM-12+2,20±0,20 с-12+9·10-4±5·10-5 с-1Fe2+реакция комплекса E1222±61 с-1мкM-1-S• с (O2•)реакция алкоксильного радикала RO• (AO• or SO•) с(O2•)превращение алкоксильного радикала RO• кислороднезависимым образом3+субстратное связывание (19-НЕТЕ) с EFeсвязывание продукта (15-гидроперокси-19-НЕТЕ) с2+EFeсвязывание активатора (13(S)-HpODE) с EFe222+24·10-4±25·10-5 с-1мкM-132·10-3±22·10-4 с-177,26±3,86 мкM104,90±5,20 мкM31,20±2,30 мкMтаблице 3.
Полученная модель предполагает бифазный характер зависимости скоростиреакции от концентрации кислорода (с компонентами высокого и низкого сродства ккислороду). Компонента с низким сродством может быть связана с участием кислорода вповторной реактивации каталитически неактивной Fe2+-формы, образующейся в процессе2+распада комплекса EFe -SОО•. Кинетическая модель предусматривает возможность2+2+обратимой инактивации фермента (распад EFe -S• и EFe -SОО• комплексов). Распад2+комплекса EFe -SОО• происходит с константой скорости k*PO=2,2 с-1, тогда как распад2+EFe -S• наименее вероятен (kPS=0,0009 с-1).
Высокая степень энантиомернойспецифичности является весомым аргументом в пользу этого предположения. Константаскорости активации фермента под действием 13(S)-HpODE (k+A) в два раза превышаетсоответствующее значение (k+P) для окисленной формы 19-НЕТЕ (15-гидроперокси-19НЕТЕ). Более того, константы Михаэлиса для связывания 13(S)-HpODE (KAM) и 152+гидроперокси-19-НЕТЕ (KPM) с восстановленной формой фермента (EFe ) такжеотличаются друг от друга в три раза, предполагая, что эндогенный пероксид являетсяменее эффективным активатором по сравнению с 13(S)-HpODE.
Таким образом,предложенная нами расширенная кинетическая модель впервые учитываетдвойственную роль кислорода в липоксигеназной реакции; он служит не толькосубстратом, но и может быть активатором фермента, что является его новой ранее неописанной функцией в случае липоксигеназ.3.3. Расчетная модель механизма транспорта кислорода в 12/15-LOX на основеметода неявного лиганда7,8Ферментативная реакция r12/15-LOX характеризуется образованием продуктовокисления с S-конфигурацией асимметрического центра. В случае произвольногораспределения молекул газа в структуре белка, контролируемого диффузией,необходимо наличие особых механизмов стереоконтроля, предусматривающих смещение2+электронной плотности в комплексе EFe -S• таким образом, чтобы образованиеасимметрическогоцентрав2+EFe -SOO•происходиловстрогоопределеннойконфигурации.
Напротив, для ряда оксидаз (цитохром С оксидазы, холестерин оксидазы идр.) была предложена возможность существования контролируемого транспортакислорода. Подобный канал был постулирован также для LOX1 сои, что также неисключало существования механизмов контролируемого транспорта кислорода и вr12/15-LOX.Тотфакт,чтокислородслужитнетольковкачествесубстраталипоксигеназной реакции, но и является активатором фермента, требует детальногоизучения механизмов его транспорта в реакционный центр LOX. Для решения этойзадачи на основе кристаллической структуры фермента, не содержащей лиганда, сиспользованием метода неявного лиганда была создана 3D-карта распределения энергииГиббса G(O2) в молекуле r12/15-LOX (рис.
9А). Карта распределения свободной энергии7CohenJ, Arkhipov A, Braun R, Schulten K (2006) Biophys J 91:1844–1857.в Институте биохимии Медицинского университета Charité, г. Берлин. Теоретическиерасчеты проведены в группе биофизики под руководством проф. Х.Г. Хольцхюттера.8Выполнено23показала, что во внутренних регионах субстрат-связывающего кармана G(O2) наиболеенизка, свидетельствуя о высокой вероятности нахождения в них кислорода.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
