Автореферат (1090325), страница 4
Текст из файла (страница 4)
4В) было исследовано влияние температуры,продолжительности УФ-облучения, а также мольное соотношение количеств[фермент/зонд] в диапазоне от 1:1 до 1:1000 на эффективность введения метки. Воизбежание неспецифической маркировки было выбрано соотношение 1:50. В этихусловиях ковалентное связывание 0,30 нмоль меченого зонда приходилось на 1,5 нмольr12/15-LOX.
Полученные данные свидетельствовали о том, что в среднем 1 молекула 19азидо-ETE (47b) связывалась с каждой пятой молекулой белка. Меченый белокподвергали протеолитическому расщеплению под действием трипсина, пептидныефрагменты разделяли с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис. 4Д). Большая частьрадиоактивно меченых пептидов имела время удерживания 67-73 мин, тогда какфотоаффинный маркер (47b) - 73,5 мин (рис.
4Г). Подобное удерживание целевыхпептидных фрагментов на обращенной фазе (С18) свидетельствовало о высокой степениих гидрофобности. Анализ меченых пептидных фрагментов осуществляли на основерезультатов аналогичных экспериментов с нерадиоактивной 19-азидо-ETE (46b) методомMALDI-TOF. Для этой цели была получена дифференциальная база данных,исключающая массы контрольных пептидных фрагментов немеченой r12/15-LOX, вкоторой предусматривалось не только ковалентное связывание с маркером (46b), но ипродуктом его ферментативного окисления [М+18]. Анализ дифференциальной базыданных позволил обнаружить фрагмент Р7 с m/z 3560, который отсутствовал в контрольТаблица 1. MALDI-TOF анализ и определение масс пептидных фрагментовПептидАмино-ПоследовательностьМассаэксп.Массарасч.GVYRVCVSTGASIYAGSKNKVELWLVGQHGEVELGSCLRPTRNKGVYRVCVSTGASIYARPTRNKEEEFKVNVSKYLGSLLFVRLRKKVELWLVGQHGEVELGSCLRPTRNKEEEFKEEEFKVNVSKYLGSLLFVRLRKKHFLKEDAWFCNWISVQALGAAEDKYWFPCYRLYQWGSWKEGLILNVAGSKLTDLPVDERFLEDKDATLETVMATLPNLHQSSLQMSIVWQLGK5113,005111,89N-терм.7877,057877,24N-терм.3733,103733,30N-терм.3658,683659,44N-терм.3620,043618,13N-терм.4141,014139,823560,233559,23C-терм.(поверхность)C- терм.(акт.
центр)кислотыР1*2-45Р2*2-68Р3*22-50Р4*46-72Р5*73-99Р6139-171Р7571-59916Локализация(домен)ном массиве и был идентифицирован как пептидD571-K599(табл.1).Этотпептидимеетаминокислотную последовательность подвижной 18спирали, которая своей С-концевой частью образуетдно субстрат-связывающего кармана и содержитдетерминанты(Ile593,Leu597),определяющиеположение субстрата в активном центре r12/15-LOX.Также, этот пептид содержит Leu589 и Gln590,выступающие в качестве детерминант позиционнойспецифичности 15-LOX2 человека. Структурноемоделирование c минимизацией энергии показало,что C-19 атом аналога АК (46b), несущийфотореактивнуюазидогруппу,расположенв593непосредственной близости от Ileв С-концевойчасти пептида (рис.
5А). Анализ фрагментовпротеолитического расщепления также позволилобнаружить наличие пяти пептидов N-терминальногоРис. 5. Расположение пептидов,модифицированныхфотоаффинной меткой.домена(Р1*-Р5*)сперекрывающейсяаминокислотной последовательностью (табл. 1, рис.5Б), которые могут быть ковалентно связаны спродуктом окисления 46b, а также пептид Р6 (табл.1), находящийся на поверхности каталитического домена. Полученные данные не толькоподтверждают возможность взаимодействия терминальной части субстрата сэлементами 18 спирали, ограничивающей полость субстратного кармана, но и впервыеэкспериментально подтверждают возможность участия аминокислотных остатков,находящихся на поверхности фермента, в процессах связывания r12/15-LOX ссубстратом.2.2.2.ЭнантиоселективноеокислениерегиоизомеровПНЖК,гидроксилированных в субтерминальной части молекулы, под действием r12/15LOX.
В соответствии с классической моделью трехмерной структуры r12/15-LOXоснование ее субстрат-связывающего кармана образовано триадой аминокислотныхостатков в положениях 353, 418/419 и 593, которые ограничивают глубину проникновенияАК в активный центр фермента, определяя тем самым его позиционную специфичность.В отличие от природного субстрата, АК, 16- (22), 17- (33) и 18-НЕТЕ (44) содержатасимметрический центр в непосредственной близости от системы двойных связей, чтоможет оказывать влияние на взаимодействие донора (бисаллильная СН2-группа) иакцептора водорода (Fe3+-OH) в процессе ферментативной реакции.
В отличие от rac-18НЕТЕ (44) r12/15-LOX окисляла rac-16-НЕТЕ (21) и rac-17-НЕТЕ (33) с ярко выраженнойэнантиоселективностью (рис. 6). В то время как 16(S)- и 17(S)-НЕТЕ являлисьотносительно хорошими субстратами фермента, их R-энантиомеры окислялись менееэффективно. Для проведения детальных кинетических исследований ферментативнойреакции в качестве субстратов были использованы индивидуальные энантиомеры 16(R)(22а), 16(S)- (22b), 17(R)- (33а), 17(S)-НЕТЕ (33b). Сравнение величин kcat/KM* для двух17энантиомеров 16-НЕТЕ также показало избирательностьфермента по отношению к (S)-энантиомеру (Кэн>30,9).
Вслучае 17-НЕТЕ энантиоселективность была менеевыраженной(Кэн7,4).Полученныеданныесвидетельствуютобубыванииэнантимернойспецифичности по мере удаления хирального атома (С16, С-17, С-18) от центра отщепления водорода (С-13).ОкислениеАКr12/15-LOXхарактеризуетсяналичиемдвойнойпозиционнойспецифичностивведения кислорода в молекулу субстрата при С-15 и С12 в соотношении примерно 10:1. Анализ ВЭЖХ напрямой и обращенной фазах продуктов окисления 16(S)НЕТЕ (22b) показал образование основного и минорногопродуктоввсоотношении93:7,содержащихсопряженный диеновый хромофор, которые былиидентифицированы с помощью масс-спектрометрии как15,16- и 12,16-DiHETE (табл. 2), соответственно. Для16(R)-НЕТЕ (21а) было обнаружено лишь небольшоеколичество неспецифических продуктов окисления.
Вслучае 17(S)-НЕТЕ (33b) соотношение продуктовнезначительносдвигалосьвсторону12липоксигеназного окисления (88:12) (табл. 2). ПриРис. 6. Избирательноеокисление rac-16- и 17-НЕТЕ в окислении 17(R)-НЕТЕ, напротив, доля 12(S),17(R)реакции с r12/15-LOX.DiНЕТЕвозрасталадо~30%.Этиданныесвидетельствовали о том, что (R)-энантиомеры 21а и 33а могут проникать глубже всубстрат-связывающий центр фермента, за счет чего реакционное расстояние междудонором и акцептором водорода увеличивается.Замена объемного Phe353 на Leu путем ведения точечной мутации F353L приводит кобразованию дополнительного пространства в активном центре r12/15-LOX, чтопозволяет АК глубже проникать вТаблица 2. Позиционная специфичность окислениясубстрат-связывающий карман. ВПНЖК r12/15-LOX и F353L мутантом.случае с 16(S)-НЕТЕ можноWT 15-LOXF353LСубстратпредположить,чтоналичиепродуктдоля(%) продукт доля(%)гидроксильной группы в (S)АК15(S)9315(S)28положении будет препятствовать12(S)712(S)72этому процессу.
Действительно,16(S)-HETE15,16(S)15,16(S)938912,16(S)12,16(S)711избирательность F353L мутанта16(R)-HETE15,16(R)6по отношению к (S)-энантиомеру12,16(R)9417(S)-HETE15,17(S)15,17(S)88316-НЕТЕ сохранялась (Кэн 14,7).12,17(S)12,17(S)129717(R)-HETE15,17(R)15,17(R)631Как и для фермента дикого типа,12,17(R)12,17(R)3799сдвига позиционной специфич16(S)-FETE15,16(S)15,16(S)692512,16(S)12,16(S)3175ностивэтомслучаене16(R)-FETE15,16(R)15,16(R)7824наблюдалось.Напротив,при12,16(R)12,16(R)227618использовании 16(R)-НЕТЕ и обоих энантиомеров 17-НЕТЕ окисление происходилопреимущественно по С-12 (табл.
23). Структурное моделирование комплекса r12/15-LOX16(S)-НЕТЕ показало возможность образования водородной связи между гидроксильнойгруппой субстрата и остатком Gln548, входящим во вторую координационную сферу Fe3+. Вотличие от 16(S)-НЕТЕ, ее фторсодержащий аналог 23а, неспособный образовыватьводородные мостики, располагался в активном центре подобно АК, о чемсвидетельствовало введение кислорода преимущественно по С-12 при использованиимутанта F353L (табл. 3). Полученные данные дают возможность предположитьсуществованиедополнительногосвободногопространства,позволяющегомодифицированному субстрату более глубоко проникать в активный центр ферментаи/или принимать конформацию, которая отличается от конформации природногосубстрата (АК) в составе фермент-субстратного комплекса r12/15-LOX.2.2.
Исследования r12/15-LOX с использованием ингибиторовлипоксигеназного окисленияВ продолжение исследований в ряду взаимодействия r12/15-LOX с лигандом былаизучена способность соединений 49-52 и 48 ингибировать ферментативную активностьr12/15-LOX.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
