Диссертация (Разработка технологий получения рекомбинантного тимозина бета-4 человека и его аналогов), страница 3
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Разработка технологий получения рекомбинантного тимозина бета-4 человека и его аналогов". PDF-файл из архива "Разработка технологий получения рекомбинантного тимозина бета-4 человека и его аналогов", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "химия" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве РТУ МИРЭА. Не смотря на прямую связь этого архива с РТУ МИРЭА, его также можно найти и в других разделах. Архив можно найти в разделе "остальное", в предмете "диссертации и авторефераты" в общих файлах, а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата химических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 3 страницы из PDF
Он также способствуетвосстановлению кожного покрова за счёт своей высокой хемотаксической активности ибыстрым притоком клеток к ране [18-21]. Тβ4 стимулирует миграцию стволовых клеток извыступающего региона волосяных фолликул, что приводит к увеличению роста волос9[22], а также эмбриональных клеток-предшественников из зоны эпикарда к сердечноймышце, что приводит к формированию новых сосудов [23]. Однако Тβ4 действует и нараковые клетки, что способствует их метастазированию [24].В связи с регенеративным потенциалом молекула Тβ4 является сегодня объектоммногочисленных исследований и рассматривается в качестве перспективной основылекарственных препаратов различной направленности.1.2. Структура Тβ4Тβ4 представляет собой короткий полипептид c молекулярной массой 4,96 кДа,состоящий из 43 аминокислотных остатков (AO), N-концевой серин, которогоацетилирован (рис.
1).Ac-SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGESРис. 1. Аминокислотная последовательность Tβ4.У Тβ4 отсутствует третичная структура, поскольку в его составе нет цистеинов.Болеетого,пептидимеетдинамичную,неструктурированнуюиподвижнуюконформацию.
Так, анализ методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) показал, что вофторсодержащей водно-спиртовой смеси Тβ4 принимает конформацию с двумяпротяжёнными участками от 4 до 16 АО и от 30 до 40 АО, представляющими собой альфаспирали [25]. В воде Тβ4 принимает конформацию спирали, которая формируется из 5-16АО, стабильной только при температурах ниже 14ºС. Сегмент, представляющий собойпоследовательность от 31 до 37 АО, также образует альфа спираль, но только притемпературах ниже 4ºС [26].
Анализ, проведённый методом кругового дихроизма,показал, что Тβ4 в водном растворе в диапазоне рН 4,5-7,5 и диапазоне температур от 5 до40 ºС проявляет слабовыраженную вторичную структуру [27].1.3. Способы получения Тβ4Впервые Тβ4 получен из природного источника – тимусовой железы [6], однаковыходцелевойфракцииэтогопептидасоставилнеболее1%.Наибольшеераспространение в 90е годы получил химический синтез Тβ4. Так, в работе Low исоавторов [28] представлен автоматический твердофазный синтез пептида на PAM-смоле(4-гидроксиметилфенилацетамидометильная смола).
В других работах был осуществёнсинтез не только дезацетилированного Тβ4 [29], но и его аналога с более высокойвосстанавливающей активностью [30]. Стоит отметить, что синтезировалась не толькополноразмернаяверсияТβ4,ноиего10фрагменты–короткиепептидныепоследовательности [31]. Так в работе Esposito и др. [32] описан синтез ацетилированногокороткого фрагмента Тβ4, представляющего последователность 17-24 АО.В настоящее время наибольшую популярность приобрёл биотехнологический способполучения Тβ4 с использованием экспрессии рекомбинантного гена в бактериальныхклетках E.
сoli, поскольку данный способ является достаточно эффективным с точкизрения стоимости конечного продукта и наименее вредным с точки зрения отходовпроизводства. В работе Но и др. [33], Тβ4 был получен с шестью остатками гистидина,упрощающими процесс очистки целевого пептида с помощью аффинной хроматографии.Однаконаличиедополнительныхпоследовательностеймоглоповлиятьнаегофункциональную активность. Исследователи Li и др. [34] создали генетическуюконструкцию, при экспрессиии которой синтезировался гибридный белок, в составкоторого входил Тβ4. Авторы добились высокой продукции гидридного белка, до 40% отобщей массы белка в клетке. Однако разработанный ими метод представляется сложнымдля масштабирования, поскольку авторы работы использовали для очистки гибридногобелка аффинную хроматографию, а для отщепления целевого пептида от аффинной меткитромбин, который выделяют из природных источников, что сильно влияет на ценуконечного продукта.
Таким образом, с точки зрения масштабирования большинствопредложенных подходов синтеза Тβ4 является нерентабельным. Существуют ещёпримерыполученияТβ4биотехнологическимспособом,гдецелевойпептидсинтезировался в составе гибридного белка с интеином [35]. Однако разница в подходах кполучению Тβ4 не имела большого значения, поскольку у всех вышеперечисленныхбиотехнологических способов имелся один и тот же недостаток – все способы позволялиполучить только дезацетилированную форму Тβ4.В работе Бейраховой и др. [36] была предложена эффективная масштабируемаясхема получения рекомбинантного препарата Тβ4 со структурой, полностью идентичнойприродной.НапервойпоследовательностейстадииполучалитиоредоксинаиТβ4,гибридныймеждубелок,которымисостоящийбылизрасположенспецифический сайт для расщепления протеиназой вируса гравировки табака (TEVпротеиназой).Послерасщеплениягибридногобелкавыделялирекомбинантныйдезацетилированный Тβ4, который затем с помощью уксусного ангидрида направленноацетилировалиацетилированнойпоN-концевойформыТβ4аминогруппенепревышалостатка55%серина.отОднакоисходноговыходколичествадезацетилированного Тβ4.
Также реакционная смесь содержала побочные продуктыреакции, что требовало ввести дополнительную стадию очистки. Более перспективным11представляется использование для ацетилирования аминогруппы N-концевого серинавысокоспецифичных ферментов – N-ацетилтрансфераз [37].1.4. Ацилирование белков in vivoАцилирование белков, т.е. посттрансляционное и ковалентное присоединениеацильной группы к белкам, является широкораспространённым способом модификациибелков (Рис. 2). Реакция катализируется специфическими ацилтрнасферазами и включаетперенос ацильной группы ацил-коэнзима А к аминокислоте.
Ацилирование можноклассифицировать в соответствии с длиной / структурой ацильных групп.Рис. 2. Различные типы ацилирования белка. A) Lys ацилирирование. B) N-концевоеацетилирование.C)N-миристоилированиеиN-пальмитоилирование.D)S-пальмитоилирование. E) Ser/Thr ацилирование. F) Ser/Thr-пальмитолеилирование [38].Ацилирование белка может иметь различные функции в клетках; небольшой ацил,например, формил или ацетил, работает в качестве элемента распознавания для белокбелковых взаимодействий, в то время как длинные цепи жирных кислот, такие какпальмитат (эфир пальмитиновой кислоты), могут участвовать во внутриклеточнойсортировке белков и доставке к мембранам, а также влияют на передачу сигнала [38].Ацилирование обычно происходит по аминокислотным остаткам Lys, Cys, Ser / Thr,несущим нуклеофильные группыацилированием(амиднаясвязь),-NH2, -SH, -ОН, и, соответсвенно называется NS-ацилированием12(тиоэфирнаясвязь)илиO-ацилированием (эфирная связь).
Есть несколько исключений, где ацилированиепроисходит по белковому N-концу, такие реакции называются N-концевое (Nк)ацетилирование, Nк-миристоилирование или Nк-пальмитоилирование [39].Nк-ацетилированиеявляетсяоднимизнаиболеераспространённыхвидовмодификации белка в эукариотах, где ацетил переносится от ацетил коэнзима А каминогруппе рождающегося пептида.
Nк-ацетилирование специфических белков можетбыть либо полным, либо частичным, в последнем случае белок существует как вацетилированной, так и в неацетилированной формах. Процесс ацетилированиянейтрализуетположительныйзаряд,обычноассоциированныйсосвободнойаминогруппой, и таким образом эффективно блокирует аминогруппу от дальнейшейионизацииидругихмодификаций.Nк-ацетилированиекатализируетсянаборомферментов – N – концевых ацетилтрансфераз (NATs). Энзиматические механизмысохраняются от низших к высшим эукариотам, что говорит о сопоставимых системах Nкацетилирования [40]. NATs проявляют различную субстратную специфичность, котораяобусловлена особенностью первых двух аминокислот в последовательности пептида [41].В основном, Nк-ацетилирование катализируется NatA, NatB и NatC ацетилтрансферазами.NatA, основной NAT-комплекс, состоит из каталитической субъединицы Naa10 ирегуляторной субъединицы Naa15 [42].
Комплекс NatA ацетилирует N-конец белка,начиная с Ala, Cys, Gly, Ser, Thr или Val после удаления iMet [41]. NatB комплекс состоитиз каталитической субъединицы Naa20 и вспомогательной субъединицы Naa25 [43] иацетилирует N-концевые Met-Asn-, Met-Asp-, Met-Gln- и Met-Glu- [44]. NatC состоит изтрёх субъединиц Naa30 (ответсвенна за реакцию ацетилирования), Naa35 и Naa38.Активность NatC нацелена на iMet, за которым следует гидрофобный остаток, такой как:Ile, Leu, Phe, или Trp [45].В отличие от эукариот, где большинство из аминогрупп ацетилированы (80% ворганизме человека), о Nк-ацетилировании белков в прокариот сообщается редко [46]. Восновном ацетилирование связано с процессом трансляции.
Например, в Escherichia coliтри Nк ацетилтрансферазы (Rimi, RimJ и Riml) специфично модифицируют рибосомныебелки S18, S5 и L12 с N-концевыми Ala-Arg-, Ala-His- и Ser-Ile- соответственно [47, 48].Наиболееперспективнымсточкизренияпроизводствапредставляетсяацетилирование белка in vivo, при котором мог бы использоваться ацетилкоэнзим А самойклетки. Идея биотехнологического способа получения белка в E. coli c ацетилированиемin vivo не нова. Так, например, Yuantao с коллегами применилиN –концевоеацетилирование in vivo для тимозина альфа 1 [49].
В качестве ацетилирующего ферментаиспользовали рибосомальную аланиновую N – ацетилтрансферазу (RimJ). Авторы статьи13пишут о высокой эффективности этого процесса. Однако, остаётся не понятно, почему дляацетилирования тимозина альфа 1, у которого, также как и в Тβ4, первым N – концевымаминокислотным остатком является серин, использовали не специфичную для этойаминокислотыацетилтрансферазу.ПрименениерибосомальнойсериновойN-ацетилтрансферазы (Riml), которая имеет более высокую специфичность по отношению ксерину, вероятно, может привести к более высокой эффективности ацетилированияпептида.1.5.