Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 106
Текст из файла (страница 106)
Иногда оказывастся невозможным получить ген в виде одного фрагмента, и тогда для определения его структуры необходимо собрать вместе данные, полученные при анализе его разных фрагментов. Для фрагментирования генома могут быть использованы два метода. Один из них — расщепление рестриктазами. При этом каждый фрагмент заканчивается сайтом узнавания специфической рестриктазы. Другой метод состоит в механическом дроблении ДНК путем внесения в нее разрывов с частотой, определяемой условиями фрагментирования. В этом случае места разрывов располагаются совершенно случайно.
Ко~да рестриктазой расщепляют всю ДНК генома, частота разрывов определяется длиной последовательности узнавания фермент.а. Чем длиннее эта последовательность, тем реже происходят случайные разрывы. Напри- Выделение из генома индивидуальных генов ную путем синтеза комплементарной цепи. В этой реакции фермент использует кДНК в качестве матрицы для синтеза последовательности, идентичной исходной мРНК. Продукт реакции — двухцепочечная молекула со шпилькой на одном конце. Шпильку разрезают ферментом нуклеазой 51 (специфическн расшепляющей одноцепочечную ДНК) с образованием обычной двухцепочечной ДНК. Двухцепочечную ДНК можно клонировать для получения больших количеств синтетического гена, который представляет последовательность мРНК в виде двухцепочечной ДНК.
Это называется клоном кДНК. (При использовании этой терминологии термин «кДНК» стал несколько неточно использоваться для обозначения двухцепочечного встроенного фрагмента, а не исходного одноцепочечного обратного транскрипта.) Одно из основных применений техники клонирования-выделение индивидуальных генов непосредственно из генетического материала. Каждый индивидуальный ген представляет собой только очень небольшую часть эукарнотического генома.
Например, размер генома типичной клетки млекопитающих составляет около 1О' п.ни так что один ген размером, скажем, 5000 п.н, составляет только 0,00005, всей ядерной ДНК. Для идентификации столь незначительного количества материала необходимо иметь высокоспецифичный зонд, взаимодействующий только с определенными, интересующими исследователя последовательностями, чтобы выделить их из огромного количества других последовательностей. Обычно применяемый метод состоит в использовании высокомеченых радиоактивных РНК- или ДНК-зондов, гибридизация которых с геном регистрируе~ся с помощью ралиоавтографии. Возникающее при этом затруднение связано с получением мРНК, соответствующей специфическому белку. Оно может оказаться крайне трудным, когда белковый продукт присутствует в клетке в незначительном количестве. Существует несколько методов выделения мРНК, основанных на использовании свойств ее продукта, в том числе чувствительный метод обнаружения продуктов син- Рис.
19.6. Блоттинг по Саузериу позволяет осуществить прямое выдслсиис фрагментов ДНК, соответствующих специфическому зонду, из смеси рсстриктов ДНК зсиома. 19, Исследование ДНК 243 Фильгровапьная бумага, ммоее нал в конце р рова ном гол вом раогворе А ароанмй геп й Дик влекцюфореаа Ди агурац м игроцелпюпоа ь й гери Сухая филмров* ная бумага 1 Рис. 19.7 При блоттвнге по Саузерну фрагменты ДНК переносят с агарозвого геля яа яитропсллюлозвый фильтр.
мер, вероятность наличия определенной последовательности длиной 4 п.н, составляет 0,25 = 1/256, поэтому фермент, узнающий такую короткую последовательность, будет вносить разрывы в ДНК довольно часто. Частота уменьшается до 1/1000 для последовательности длиной 5 п.н. и до 1/4000 для последовательности длиной 6 п.н. (Этот расчет основан на предположении о том, что каждое основание представлено в ДНК с равной часто~ой, чего обычно не бывает. Частота внесения разрывов может быть уменьшена при использовании фермента, чья последовательность-мишень содержит пары оснований, встречающихся в ДНК реже других, и наоборот.) Распределение сайтов узнавания фермента носит случайный характер по отношению к геному в целом. Поэтому обработка эукариотической ДНК рестриктазами приводит к образованию множества фрагментов.
При электрофорезе в геле эти фрагменты образуют пятно, в котором неразличимы отдельные полосы (за исключением ряда полос, соответствующих некоторым повторяющимся последовательностям, рассмотренным в гл. 24). Однако при наличии специфического зонда в пятне рестриктов можно обнаружить соответствующие ему последовательности. Последовательность операций такого метода приведена на рис.
19.6. Ключевой момент — денатурация ДНК с образованием одноцепочечных фрагментов, которые переносят из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр, где они иммобилизуются. Процесс переноса ДНК несколько похож на промокание (по-английски-блоттинг), и в разговорной речи этот термин используется для его обозначения. При работе с ДНК такой метод известен под названием блоттинга по Саузерну (Боп1Ьегп Ыо11(пя) (по фамилии автора метода). На рис.
19.7 схематически изображена последовательность операций по переносу фрагментов ДНК. Агарозный гель помещают на фильтровальную бумагу, замоченную в концентрированном солевом растворе. Затем на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр и сверху помешают сухую фильтровальную бумагу. Солевой раствор впитывается в сухую фильтровальную бумагу. Чтобы это произошло, он должен пройти сквозь агарозный гель и затем через нитроцеллюлозный фильтр.
ДНК переносится вместе с раствором, но задерживается нитроцеллюлозой. Иммобилизованную нитроцеллюлозой ДНК можно гибридизоватып гйш с радиоактивным зондом. Со специ- фическим зондом будут гибридизоваться только комплементарные ему фрагменты. Поскольку зонд радиоактивен, гибридизацию можно обнаружить с помощью радиоавтографии. Каждая комплементарная последовательность проявляется в виде радиоактивной полосы, местоположение которой определяется размером фрагмента ДНК. Метод также можно применять и для РНК. Для переноса РНК с агарозы в среду, пригодную для проведения гибридизации, его необходимо несколько видоизменить. Такой метод известен под названием Нозерн-блоттинга'. Клонирование всей ДНК генома («шотган») с образованием библиотек генов Прямое вьшеление фрагментов генома, соответствующих зонду, сопряжено с практическими трудностями, и для выделения отдельных генов используют эффективный метод с обратным порядком стадий, когда вначале проводят клонирование генома, Затем проводят отбор клона(ов), содержащего специфическую последовательность.
Векторы, несущие ДНК, полученную из генома, называют клонами геномной или хромосомной ДНК (в отличие от клонов кДНК, являющихся копиями мРНК). Клонирование всего генома (в противоположность клонированию специфических фрагментов) часто называют ешотган»-экспериментами (бЬо1япп ехрегппеп1 — метод дробовика). Для их осуществления весь геном разделяют на фрагменты удобного размера. Затем фрагменты встраивают в клонируюший вектор с образованием популяции химерных векторов. Набор таких клонированных фрагментов называют библиотекой генома. Библиотека, однажды полученная с помощью фагового или плазмидного вектора (чаще — фагового вектора, поскольку в таком виде легче хранить необходимые большие количества химерных ДНК), может храниться неограниченно долгое время и при появлении нового зонда быстро может быть использована для поиска специфического фрагмента.
Клонирование фрагментов, полученных путем механического дробления, сопряжено с рядом технических трудностей; в вектор легче встроить рестрикт. Однако сложность такого встраивания состоит в том, что сайты рестрикции могут находиться в неудобных местах, например в середине гена, который надо клонировать. Один из способов преодоления этой трудности состоит в использовании более чем одной рестриктазы, т.е. в повторении эксперимента с различными ферментами, сайты узнавания которых занимают разные положения. Но это требует дополнительного времени, и при работе с длинной последовательностью бывает сложно найти фермент, не разрезающий ее.
Поэтому для создания удобной библиотеки путем клонирования рестриктов пользуются приемом, так регулирующим частоту внесения разрывов, чтобы получились более длинные фрагменты. Для этого используют фермент с короткой (4 п.н.) последовательностью узнавания в условиях, обеспечивающих частичную рестрикцию ' ЯопсЬсгп (Саузерв), по имени которого назван оригинальный метод, по авгп. означает южный. По аналогии вндоязмеясяяый метод назван хойьсгп (возсрв), т.с. северный.— Прим.
рад. 244 Часть Ъ'. Строение генома эукариот Реплика аермнт копии те» ме колоний е твх ме самь х поломеннях.радноавтотрафтм выпвляет нвянчне меткн во всех колоннах «нмарнык плазмнд, нвсумн» последоватальностн, комплвмантврные зонду Матрнчнвя ча нка — чашка Пир» с 16 Евктернвльнымн коланнямн Рис. !9.8 Гибридизапия колоний позволяет осуществлять се- лекцию химерных плазмид, несущих специфическую последова- тЕПЬНОСтьо За СЧЕТ ЕЕ КОМПЛЕМЕНтаРНОСтИ С РаДИОаКтИВНЫМ зондом. ДНК. Любой специфический сайт-мишень разрезается совершенно случайно, поэтому ирису~стане сайта-мишенн в некоторой последовательности не обязательно приведет к ее разрыву.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
