Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 107
Текст из файла (страница 107)
Малая вероятность разрезания по каждому сайту в сочетании с частым расположением сайгон означает, что распределение фрагментов обеспечивается практически полностью случайным характером внесения разрывов в геном. При этом каждый фрагмент заканчивается одной и той же последовательностью, которая может иметь липкий конец и поэтому удобна для клонирования. Число случайно полученных фрагментов, которые должны быть клонированы для того, чтобы обеспечить высокую вероятность наличия кансдой последовательности генома хотя бы в одной химерной плазмиде, уменьшается с ростом размеров фрагмента н увеличивается с ростом размеров генома и желаемой вероятности.
Для 99",-ной вероятности необходимо 1500 клонов с фрагментами ДНК Е. со!1; для дрожжей размер библиотеки возрастает до 4600 клонов, для О, ее!аподаепег — до 48000 и до 800000 — для млекопитающих. Все эти библиотеки клонированных фрагментов, где достигается такая ве- роятность представленности последовательностей генома, были получены. Как осуществляю~ селекцию определенного клона геномной ДНК из библиотеки? Один из методов называется гибридизацией колоний.
Последовательность операций этого метода приведена на рис. з9.8. Бактериальньае колонии, несущие химерные векторы, лизируют на нитроцеллюлозных фильтрах. Затем их ДНК денатурируют и фиксируют на фильтре. Фильтр гибрндизуют с радиоактивным зондом (обычно это клонированная кДНК), соответствующим интересуюшей исследователя последовательности. Все колонии, с которыми гибридизуется зонд, при авторадиографии выявляются в виде темных пятен. После этого соответствующие химерные векторы могут быть выделены из исходной библиотеки.
Для гибридизации с зондом достаточно, чтобы клоны геномной ДНК содержали только часть комплементарной ему последовательности 1обычно считают, что минимальный размер клоннрованной последовательности должен составлять около 50 п.н.). На практике, когда эукариотический ген имеет значительный размер, при создании библиотеки он может оказаться фрагментированным, так что разные участки гена окажутся в разных клонах, гибрндизующихся с зондом. Полную нуклеотидную последовательность, соответствующую зонду, может не содержать ни один из клонов геномной ДНК.
В этом случае необходимо реконструировать исходную геномную последовательность, используя наличие перекрываний индивидуальных фрагментов, которые, по всей видимости, имеют разные концы. Важное допущение, лежащее в основе этого подхода, состоит в том, что клонированная эукарнотическая последовательность будет сохраняться в бактериальной клетке в неизменном виде. Основанием для тако~о предположения служат имеющиеся данные.
Однако существует ряд исключений из этого правила, когда при заражении бактериальной клетки-хозяина происходят делецнн клонированной последовательности. Эукариотические гены могут экспрессироваться в бактериях с образованием белка Вследствие универсальности генетического кода определенная кодирующая последовательность всегда будет содержать одну и ту же информацию. (Единственное исключение — митохондриальные гены, где имеются отличия в генетическом коде, как описано в гл.
4.) Поэтому при встраивании в вектор интактной последовательности, кодирующей эукариотическнй белок, возможна транскрипция этой последовательности с образованием мРНК, которая может транслироваться в бактерии-хозяине. Единственные отличия состоят в том, что в синтезироч ванном белке могут отсутствовать модификации, имеющиеся в природном клеточном белке, и, конечно, все~да существует риск, что полипептидная цепь в бактериальной клетке окажется нестабильной.
Однако при наличии в клетке подходящих условий любая эукариотическая последовательность может быть транслирована с образованием соответствующего белка. Какие условия необходимы для эффективной экспрессии эукариотическнх ~снов в бактериях? Поскольку нуклеотидные последовательности эукарнотических и прокариотическнх промоторов различаются, для того чтобы 20. Структурные гены; внутренняя организация 245 У веток свламваиил Промотор рибосомм мРНК Глава 20 СТРУКТУРНЫЕ ГЕНЫ: ВНУТРЕННЯЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ген экспрессировался, он должен быть помещен под контроль бактериального промотора. Это достигается путем включения эукариотической кодируюшей последовательности в уже имеющуюся транскрипционную единицу, но обычно этого недостаточно для эффективной трансляции.
Поэтому часто эукариотический фрагмент встраивают рядом с промотором, который обеспечивает его транскрипцию с образованием моноцистронной мРНК. Это можно осушествить, если найти подходящий сайт для встраивания фрагмента в клонируюший вектор; в качестве промотора широко используе~ся промотор гена устойчивости к ампициллину, локализованного в векторе рВК322 (обычный продукт гена †ферме )3-лактамаза). Другой метод состоит во встраивании в клонируюший вектор природного бактериального промотора с целью экспрессии чужеродного гена. Популярным промотором, используемым для этой цели, является )пс-промотор (промотор лактозного оперона) Е.
со(1, причем чаще используют его мутантную форму. Для того чтобы синтезированная мРНК транслировалась, в непосредственной близости от инициируюшего кодона АНО должен находиться участок связывания рибосомы. Были сконст.руированы клонируюшие векторы, у которых сайт рестрикции для встраивания чужеродной ДНК находится рядом с участком связывания рибосомы. Обычно это достигается благодаря тому, что вставка содержит колон А()О. На рис. 19.9 показано, как любая последовательность чужеродной ДНК (прокариотической или эукариотической), начинающаяся с кодона А\3О, может быть встроена в этот участок и будет транскрибироваться и транслироваться в бактериях. В результате синтезируется белок, точно соответствующий кодируюшему участку вставки.
Другой метод состоит во встраивании кодируюшей последовательности в участок, находящийся непосредственно за местом начала синтеза бактериального белка. В результате образуется гибридный белок с )М-концевой областью, соответствующей бактериальному белку, последовательность которого была прервана, и остальной частью белка, соответствующей встроенной чужеродной ДНК. )а(-концевая бактериальная последовательность может быть очень короткой и полезной. Например, она может представлять собой сигнальную последовательность, обеспечивающую секрецию гибридного белка в окружаюшую среду; она может также служить для зашиты гибридного белка от деградации в бактериальной клетке. Каковы возможные источники получения эукариотической кодируюшей последовательности? Поскольку мно- В течение длительного времени существовали нечеткие представления о том, что эукариотические гены в чем-то необычны, что они могут принципиально отличаться от бактериальных генов.
Причины существования такого взгляда крылись в явном несоответствии содержания ДНК сложности организма, получившем отражение Саят рес рикиии 1 1 вектор арьот)рчрррстсррьр(тсрбъфреочососссбстоарсбюж ПослеловаАпц теле с т -вс аека Лектор тк "Расасссоьрар".Юрасесчраочсррлрррьрюттс Век.ор Белок ЯБЛКЯачлгплЯ 1'нс. 19.9. Любая эукарнотячеекая кодирующая последовательность может экспресснроваться с образованием белка лрн ее встраивании в подходящий участок клоннрующего вектора. гие эукариотические гены имеют прерывистое строение, кодирующая последовательность в клоне геномной ДНК также может прерываться.
В таких случаях белок, соответствующий геномной ДНК, в бактериях не синтезируется. Поэтому копирующую белок последовательность лучше всего выделять из клона кДНК, полученного на матрице мРНК, с непрерывной кодируюшей последовательностью. Тогда она может не включать 5'- н 3'-нетранслнруемые участки; достаточно кодируюшей последовательности, начинающейся от инициаторного А()О- кодона и заканчиваюшейся терминируюшим кодоном.
Иногда возникает необходимость охарактеризовать бактериальный промотор, но продукты находяшихся под его контролем генов проанализировать трудно. Эта трудность преодолима при использовании обратного порядка операций — с присоединением к промотору генов лактозного оперона, продукты которых можно легко обнаружить. В этом случае об активности промотора судят на основе стандартных определений В-галактозндазьь Рекомендуемая литература Вопросы, затронутые в этой главе, подробно изложены в книг Льюина Б.
(г.ею(и Вл Селе ехргеээюп, 2, Епсагуотгс сЬготоэогпез, Ъ'йеу, )а(ечр атог(г, 1980, рр. 761 — 785). Более ранний обзор составлен Синшеймером (5)нэ)аеллег, Апп. Кеч. В(ос)эеши ч. 4б, 1977, рр. 415 — 438). в виде так называемого парадокса величины С. Такая точка зрения была подкреплена результатами экспериментов по определению сложности генома, показавших, что только небольшая его часть может быть представлена в виде мРНК (гл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
