Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 104

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 104)

Это оказывается полезным при создании клонирующих систем. Обычно используют плазмиду, несущую лва гена, обеспечивающих устойчивость к разным антибиотикам. Один из них служит просто для идентификации бактерий, несущих плазмиду, путем отбора клеток, устойчивых к антибиотику, Другой служит для того, чтобы отличи~ь гибридную плазмиду от родительского вектора. Если сайт встраивания чужеродной ДНК находится внутри такого гена, гибридная плазмида теряет устойчивость к антибиотику. Таким образом, селекция родительского вектора может производиться по признаку устойчивости к двум антибиотикам, в то время как отбор гибридной плазмиды может основываться на сохранении устойчивости к одному анзибиотику и чувствительностн-к другому. Часто природные плазмиды обладают многими, но не всеми необходимыми свойствами клонирующего вектора.

В целях создания лучших векторов из исхолного природного материала было разработано несколько подходов. Эти подходы могут заключаться во внесении изменений в систему контроля репликапии или в добавлении в плазмиду генов, определяющих устойчивость к специфическим антибиотикам. Один из стандартных клонирующих векторов, наиболее широко используемых в настоящее время, РВЛ322, был получен путем нескольких последовательных изменений ранее существующих клонирующнх векторов.

Это мультикопийная плазмида, несущая гены устойчивости к тетрацнклину и ампициллнну н имеющая в удобных участках сайты рестрикции для нескольких рестриктаз. Фаги представляют собой другой тип векторных систем. Обычно фаг-это линейная молекула ДНК, поэтому внесение одного разрыва рестриктазой приводи~ к образованию двух фрагментов.

Эти фрагменты сшивают с чу- Паамдн н вектор Внасениеразр ва зад стае н й с ецнфиеск й сай Ф Сшивание концов Оазрмва с концами ЕУ ЕРОДНОйДНК Химер- а алаз- мндв Зара кение бактерии е деле ие колзцевмк молекул ДНК з клеток латомстаа Рис. 19.1. Лззазмвдньте векторы могут быть иопплйъэлапы ддя клонирования любого фрагмента ДНК, встрдняаемото в соответствующий участок.

жеродной ДНК с образованием химерноуо фага, как показано на рис, 19.2. Для выделения геномов химерных фагов необходимо, чтобы фаг прошел цикл литнчсской инфекции с образованием фаговых частиц. Преимущество этого метода состоит в простоте получения химерных геномов. Однако он накладывает ограничения на длину чужеродной ДНК, которая может быть клонировапа, поскольку размер головки фага препятствует упаковке в размножившихся частицах слишком длинных молекул ДНК. Часто для решения этой проблемы фрагмент вектора, не несущий необходимых для жизнедеятельности фага генов, эа.меняют на чужеродную ДНК вместо ее просто~о встраивания в качестве дополнительного материала. Такой подход дал блестящие результаты в случае фага )., где путем преобразования ДНК был получен более короткий геном (содержащий только жизненно важные гены), включающий только один сайт рестрикции для рестриктазы ЕсоК1.

Сам по себе этот клонируюший вектор слит«ом короток для его упаковки в головке фага, кото- 238 Часть Ч. Строение генома эукариот фагоааф аа тор пр разрыаеогфазеотоя даа фрагыанта ШШШШ Приооадинанне концаа к ттн ероднои ДНК нтттгглгятт . фаГ Зараыание бактерии и аыдаяание зренык фатов ~н а ц рдрдртртрер(т) р(чрб) . Сзр(т)р(т)р(т)р... 5' 5' .. Рйрб)РГчРкз з ... нрнрб)рертртрдрдр Рис. 19.2, Фаговые векторы могут быть использованы для кло- ниреваиия чужеродной ДНК, встраиваемой в область генома фага, ас содержащую жизненно иеобходимыо гены.

рая накладывает ограничения не только на максимальную, ио и на минимальную длину генома. Таким образом, чтобы получить фаг, способный размножаться с образованием зрелых фаговых частиц, в разрезанный родительский вектор должен быль непременно встроен фрагмент чужеродной ДНК, Это приводит к созданию автоматической селективной системы для получения химерных фиговых геномов. Ценность таких векторов возросла с появлением систем упаковки ДНК в фаговую частицу (п Игго. Попытка объединить некоторые преимущества плазмид и фагов привела к созданию космид. Это плазмиды со встроенными специфическими последовательностями ДНК (еоб.сайтами), отвечающими за упаковку ДНК фага Х в фаговой частице.

Такие векторы по-прежнему могут существовать в бактериях в виде плазмид, но могут быть выделены и в чистом виде путем их упаковки в фаговые частицы 1п сйго. На длину этих векторов также накдадывается ограничение, обусловленное размером головки фага, но такой геном не должен включать гены, необходимые для литического цикла. Мы рассмотрели клонирующие векторы применительно к использованию бактериальной клетки-хозяина. Иногда в качестве клетки-хозяина бывает удобно использовать эукариотическую клетку. Единственные известные природные эукариотические плазмиды обнаружены у дрожжей. Путем реконструкции ДНК были получены бирепликонные (г)па!-рпгрозе), или «челночные», плазмиды, в состав которых входят последовательности, необходимые для их существования в клетках как Е со)(, так и 8.

сегериые. Таким образом, один и тот же вектор может быть использован как с одним, так и с другим хозяином. Г!олучение химерной ДНК Для присоединения фрагмента чужеродной ДНК к клонирующему вектору необходимо осуществление реакции взаимодействия между концами фрагмента и вектора. Это можно обеспечить путем образования кон- цевых комплементарных последовательностей у фрагмента и у вектора так, чтобы при смешивании они смогли образовать химерную ДНК. Наиболее распространенный метод состоит в использовании рестриктаз, вносящих ступенчатые разрывы с образованием коротких комплементарных одноцепочечных липких концов. Классический пример такого фермента — рестриктаза ЕсоК1, разрывающая каждую из цепей двухцепочечной ДНК, но в разных точках.

Эти точки располагаются по обе стороны от короткого палиндрома, входящего в состав сайта узнавания фермента. Для изображенной ниже последовательности ДНК, где )ц) обозначает основания, не узнаваемые ферментом, ЕсоК1 вносит разрыв в свой сайт узнавания (вьшщген красным цветом) в точках, отмеченных вертикальными стрелками: .

Р "т)рб)рб) РЗРАРАРтР тр С Рб)Р(т)Р(т) а)Р(т)рб)РСРтртрдрдрО Р(т)Р(т)Р(т)Р Фрагменты ДНК по обе стороны от сайта-мишени отсоединяются, и вследствие взаимного сдвига сайтов рестрикции каждой цепи ДНК на каждом из фрагментов образуются выступающие, комплементарные друг другу одноцепочечные участки — липкие концы (выделены красным цветом): Комплементарность липких концов позволяет им реассоциировать за счет спаривания оснований. Когда ЕсоК1 «разрезает» две разные молекулы, на каждой из них образуются одинаковые липкие концы. Это делает возможной реассоциацию молекул„ что показано на рис. 19.3. Такой метод позволяет получить химерную плазмиду, интактную в целом, но с отсутствием ковалентных связей между векторной и чужеродной ДНК.

Отсутствующие связи образуются при действии фермента ДНК-лигазы щ Мго. Этот метод рекомбинации двух молекул ДНК имеет свои достоинства и недостатки. Достоинство метода состоит в том, что химерная плазмида имеет восстановленные сайты узнавания для ЕсоК1 по обе стороны от встроенной ДНК. Поэтому фрагмент чужеродной ДНК относительно легко может быть выделен из клонированных копий химерного вектора с помощью расщепления рестриктазой ЕсоК1. Недостаток метода состоит в том, что все полученные с помощью ЕсоК! липкие копны могут реассоциировать друг с другом. Из-за этого часть векторов восстанавливается в результате непосредственного взаимодействия своих концов без присоединения к встраиваемому фрагменту ДНК, тогда как другие векторы могут присоединяться к вставке, состоящей из нескольких последовательно соединенных фрагментов чужеродной ДНК.

Поэтому необходимо осуществлять селекцию химерных плазмид, несущих только один встроенный фрагмент. Сложность метода, основывающегося на использовании только таких рестриктаз, с помощью которых получают концы, участвугощие в реакции сшивания, состоит 19. Исследование ДНК Ппазм Пнмй аактор Встракааамап ЛН К Разреза ие рестриктазой Есом Разрезани рестриктазой Есон! Запапнание брешей е «имерной ппазмийе с помою ю пю'азм Рнс. 19.3. Любая послеловательность ДНК, находящаяся между свйтамн рестрикции ЕсоК1, может быть встроена в плвзмндный вектор, имеющий свйт рестрикции для ЕсоК!, путем разрезания н ревссоцнвцнн двух молекул ДНК.

Характеристики

Список файлов книги