Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 99
Текст из файла (страница 99)
Кинетические компоненты, подбираемые в ходе анализа кривой, не соответствуют отдельным фракциям повторяющихся последовательностей генома; это только полезное приблюкение для его описания. Для большинства эукариотических геномов достаточно подобрать два или три компонента, чтобы описать весь набор повторяющихся последовательностей.
Часть генома, приходящаяся на долю повторяющейся ДНК, варьирует в широких пределах. Для низших эукариот большая часть ДНК представлена неповторяюшимися последовательностями н только 10 — 20, ДНК приходится на одну или более фракций умеренно повторяющейся ДНК. В клетках животных до половины всей ДНК составляют фракции умеренно повторяющейся и высокоповторяющейся ДНК. У растений и амфибий доля повторов может быть даже выше, иногда составляя большую часть 228 Часть У.
Строение генома эукариот ог— о я 0,4 й ов - о,в о,оз зо гооо зо,ею з,о со' Рнс. '17.5. Прн исследовании кинетики реассоцнацни ДНК 5. ригрнгагиа можно выделить несколько компонентов. Экспериментальная кривая проведена через гочки, соагвегсгвуюшие из- генома, где на долю умеренно и высокоповторяющихся последовательностей приходится до 80",~,' ДНК. Длина нсповторяющейся ДНК имеет тенденцию к увеличению при возрастании размеров генома в целом, хотя прямо с этим не связана.
Это несколько уменьшает парадоксальность значений величины С в том смысле, что диапазон значений сложности неповторяющейся ДНК меньше диапазона значений размеров генома. Если предположить, что гены сосредоточены в пределах неповторяющейся ДНК, остается справедливым то, что следует по-прежнему найти объяснение существенным различиям в сложностях геномов, которые, по-видимому, не соответствуют морфологическим особенностям организма, но степень различий которых становится меныпе.
Например, сложность неповторяющейся ДНК плодовой мушки составляет ! !0 и. и., а ДНК комнатной мухи — 2,8 10' п. н.; таким образом, наблюдается различие только в 3 раза, размеры жс геномов различаются в 6 раз. Сложность нсповторяющейся ДНК млекопитающих составляет окодо 9 10к п. н., лягушки Х, 1аербч — 1,б 1ОЯ п.н.. а у растений и амфибий достигает примерно 9 10ч п.п. Наконец, следует подчеркнуть, что не существует одного определенного свойства, которое характеризовало бы все эукариотические геномы. Уже упоминалось, что в клетках растений, ставших полиплоидными недавно [по эволюционной шкале), уникальная ДНК может отсутствовать, поэтому наиболее медленно рсассопиирующая фракция имеет частоту повторяемости 2 3 и бопее (Действительно, это, по-видимому, временная стадия в эволюции, которая обычно приводит к дивергенции и появлению вновь уникальной ДНК.) В геномах ракообразных может совсем отсутствовать умеренно повторяющаяся ДНК, а присутствовать только высокоповторяющаяся и уникальная ДНК.
У ннзших эукариот может отсутствовать высокоповторяющаяся ДНК. Члены семейств повторяющихся последовательностей сходны, но не идентичны Различные компоненты эукариотической ДНК могут быть выделены путем фракционирования двухцепочечных молекул в соответствии со значениями С„г, необходимы- меренным значениям; кривые без зксперименгальиык зочек соогвез- ствунзг трем рассчитанным компонентам (минимальное число), которые в сумме могут образовать зксперименгальиую кривую.
ми для их ренатурации. Суть метода состоит в проведении реакции рснатурации только до достижения определенной величины С г. В этот момент ренатурировавшую ДНК выделяют из смеси на основе ее двухцепочечного строения; остальная часть ДНК остаемся одноцепочечной. Обычно двухцепочечныс и одноцспочсчные молекулы разделяют на колонках с гидроксиапатитом, который преимущественно связывает двухцепочечную ДНК. Поведение рснатурировавшей неповторяющейся ДНК очень похоже на поведение исходного препарата ДНК до его денатурации. Прн проведении денатурацни ренатурнровавший препарат быстро плавится при Тпл, значение которой чуть ниже значения Т„л исходной нативной ДНК.
Это означает, что реассоциация цепей прошла точно. Каждая уникальная последовательность сгибридизовалась с полностью комплементарным сй участком. Совершенно иначе ведет себя ренатурнровавшая повторяющаяся ДНК, которая медленно плавится в пределах широкого интервала температур, как показано на рис. 17.6. Это означает, что она состоит из молекул, спаренных не совсем точно. Напротив, в этом случае в рснатурировавших двухцепочечных молекулах должно быть значительное количество ошибок спаривания. Действительно, чем больше имеется ошибок спаривания в молекуле, тем меньше водородных связей должно быль разрушено при плавлении и поэтому тем ниже Т„л Ширина кривой плавления свидетельствует о том, что ренатурировавшая цовторяюшаяся ДНК содержит спектр последовательностей, начиная с последовательностей, образовавшихся при реассоциации лишь частично комплементарных участков, и кончая последовательностями, образовавшимися при реассоциации почти или даже полностью комплементарных участков ДНК.
Как это может цроизойти7 Фракция повторяющейся ДНК состоит из семейств сходных, но нс идентичных последовательностей. В состав каждого семейства входит набор нуклсотидпых последовательностей, имеющих достаточнос сходство, чтобы ренатурировать друг с другом. Различия же обусловлены заменами оснований, вставками и делециями, приводящими к появлению внутри сходных последовательностей точек, в которых не может происходить спаривание оснований комплементарных цепей. Число ~аких 17. Геномы эукариот: множество последовательностей 229 изменений определяет степень взаимодействия между двумя любыми последовательностями. При ренатурации двух членов семейства, обладающих большим сходством, образуется дуплекс с высокой T„я; при ренатурации последовательностей с меньшим сходством образуется дуплекс с более низкой Т„,.
Способность сходных, но не идентичных комплементариых последовательностей узнавать друг друга может определяться жесткостью условий проведения реассоциапии. Более жесткие условия обеспечиваются, например, повышением температуры, препятствующей спариванию не полностью комплементарных участков ДНК. Так, проводя реакцию гибридизации при более высоких температурах, можно добиться того, что будут реассоциировать только члены семейства, обладающие довольно значительным сходством.
При более низких температурах может происходить отжиг и менее сходных членов семейства. Обратите также внимание на тот факт, что при увеличении жесткости условий гибридизации возрастает также доля последовательностей генома, ведущих себя как неповторяюшаяся ДНК. При исследовании семейств повторов обнаруживается большое разнообразие в их строении.
В некоторых случаях можно четко выделить семейства, члены которых имеют большое сходство. Такие семейства выявляются даже при увеличении жесткости условий гибридизации. В других случаях обнаруживается множество последовательностей, обладающих различной степенью сходства, так что при увеличении жесткости условий гибридизации размер семейства постоянно уменьшается.
Определение размера таких семейств повторяющихся последовательностей является произвольным, поскольку зависит от конкретных условий гибридизации. Эти данные говорят о том, что геномы эукариот содержат сходные последовательности, произошедшие, по всей вероятности, путем дивергенции из некоторой общей исходной последовательности, количество копий которой в геноме увеличилось во много раз; степень сходства копий, однако, очень сильно варьирует. Реассоциация двух сходных, но не идентичных последовательностей происходит медленнее, чем реассоциация идентичных последовательностей. Это означает, что для реассоциации сходных последовательностей требуется большее значение Саг.
Поэтому значения Сагпш наблюдаемые для фракций повторов, могут быть выше, чем это соответствует их действительной сложности. Таким образом, большинство фракций повторяющихся последовательностей имеют более низкие значения сложности и большую частоту повторяемости, чем это следует из кинетики их реассоциации. Мы увидим, что это особенно характерно для высокоповторяющейся ДНК (гл. 24). Участки умеренно повторяюшейся ДНК чередуются с участками неповторя!ощейся ДНК В большинстве геномов ни умеренно повторяющаяся, ни уникальная ДНК не существуют в виде длинной непрерывной последовательности, не прерываемой другими ьо Умеренно аааюрню. шаюн дню 8 е к аа Од % а 0,9 Ь анаша ме « днк Наеме ен дНК 90 70 ВО 90 .с коьпюнентами генома. Напротив, оба этих компонента присутствуют в виде отдельных последовательностей, чередующихся друг с другом.
Во многих случаях их чередование характеризуется определенной регулярностью. Наиболее распространено чередование коротких последовательностей, при котором умеренно повторяющаяся ДНК присутствует в геноме в виде отдельных последовательностей со средней длиной около 300 п. н. Эти последовательности перемежаются с неповторяюшимися последовательностями, средняя длина которых колеблется в различных геномах от 800 до 1500 п.н. Последовательности, расположенные таким образом, могут составлять около половины всего генома и обычно включают большую часть как умеренно повторяющейся, так и уникальной ДНК.
В некоторых геномах обнаруживается чередование длинных носледователыюстей, когда также наблюдается чередование участков умеренно повторяющейся и неповторяюшейся ДНК, но последовательности каждого типа имеют существенно большую длину. Ни прн одном из способов чередования не обнаруживается каких-либо важных свойств, которые объяснялись бы именно этим способом.
Рекомендуемая литература Основным источником данных, приведенных в этой главе, послужила книга Б. Льюнна (Ьеер!и, Оепе ехргезз!оп, 2, Еисагуойс СЬгошозошез, %йеу, о!еуу з'ог)г, 1980, рр. 479-530). Технику провеления реассоциации разработали Бриттен и Кон (Випел, Ко!еле, Бс!енсе, 1968, т. 161, рр. 529 — 540), а последующие разультаты приведены в обзорах Бриттена и дэвидсона (Вицел, (зао!йол, ( !паг!. Век Вю1н 1971, 46, рр. 1!1-133 и Оваг!. Век Вю!н 1973, 48, рр. 565-6! 3). Рис. !7.6. Денатурапия Реассоциаровавшей иеповторяюшайся ДНК происходит в узком интервале температур, близком к та-.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
