Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 101
Текст из файла (страница 101)
Основная сложность при интерпретации этих данных связана с выяснением природы вообще не гибрилизующихся последовательностей, которые часто составляют ло половины всей РНК. Возможно, что большая часть !оо л 75 х О Ы и 50 аа !О !О ~ !О г !О 1 ! !О !О2 !Оз за Рис. !8.!, Сопоставление кривой гибридизации мРНК-зонда с кривой реассооиации указывает на то, что основная часть последовательностей мРНК считывается с неповторяющейся ДНК, а остальные последоватсльности - с умеренно повторяющейся ДНК.
На высокововторяюшейся ДНК мРНК не синтезирую гся. такого материала соответствует уникальным последовательностям. Одна из причин, по которой эти молекулы не вступают в гибридизацию, может состоять в том, что онн относятся к мРНК, присутствующей в очень больших количествах, достаточных, чтобы предположение о том, что в зонде их мало по сравнению с ДНК, оказалось неверным. Иными словами, если в реакции, определяемой концентрацией ДНК, нет достаточно~о избытка ДНК, некоторые РНК могут не вступить в гибридизацию.
Из этих данных слелует, что большую часть мРНК, возможно до я(у%, составляют послеловательноств, гибрилизуюшиеся с последовательностями неповторяюшейся ДНК. Поскольку очень низкую степень повторяемости генов трудно обнаружить (особенно когда их копии сходны, но нс идентичны, так что реассопиация замедляется из-за ошибок спаривания), то можно утверждать только, что они присутствуют в геномс в количестве менее трех или четырех копий, но не то, что они абсолютны уникальны. Лишь небольшую часть генов можно безусловно отнести к повторяющейся ДНК; являются лн такие множественные копии идентичными или просто сходными, при исследовании кинетики гибридизации выявить не удается. Обратите внимание на то, что, поскольку эти эксперименты рассматриваются с точки зрения общего количества мРНК, а разные гены экспрессируются с образованием разных количеств мРНК, этим методом нельзя подтвердить, что 80;:„ генов относится к фракции неповторяюшейся ДНК, хотя, по-видимому, ббльшая их часть к эз.ой фракции относится.
Была исследована кинетика гибридизации индивидуальных мРНК, соответствующих некоторым генам; наиболее интересные результаты получены для и- и (3- глобиновых генов нескольких видов млекопитающих. Полученные данные обычно указывают на существование одной или двух копий каждого гена. На самом деле эти данные дают заниженную оценку числа сходных последовательностей в геноме, поскольку в экспериментах по прямому выделению генов часто обнаруживаются дополнительные сходные с ними последовательности (гл, 2!). Часть У. Строение генома эукариот 232 Ф ? 1 и о 1,0 0 1п2 )г= '~~01112 (9) Сколько уникальных генов экспрессируется? Число последовательностей неповторяюшейся ДНК. представленных в виде РНК, может быть определено непосредственно как доля ДНК, способной гибридизоваться с РНК. При гибридизации небольшого количества одноцепочечной ДНК с большим количеством РНК все последовательности ДНК, комплементарные РНК, вступят в реакцию с образованием гибрида РНК-ДНК.
Такой метод называется методом насыщающей гибридизации, поскольку его основной признак — наличие избытка РНК, достаточно большого для того, чтобы каждая присутствующая комплементарная последовательность ДНК вступила в гибридизацию. Основной параметр такой реакции, определяемой конценз рацией РНК,— произведение концентрации РНК на время, называемое йпг. Этот параметр в точности аналогичен величине С г, используемой для описания реакций, определяемых концентрацией ДНК. Обычно реакцию насыщающей гибридизации изображают в виде графика, на котором процентам гибридизации соответствуют значения Гчпь Такого рода кривая представлена на рис. 18.2.
В данном случае реакция завершается при значении Ггпг, равном примерно 300, но ее необходимо проводить и дальше, чтобы быть увереннымн в достижении плато. Прн дальнейшем увеличении Япг до 1200 ДНК более не вступает в гибридизацию; это показывает, что сгибридизовалась действительно вся ДНК, которая могла вступить в реакцию. Зная процент гибридизации ДНК, можно определить число генов, представленных в популяции мРНК и участвующих в реакции. При достижении насыщения в гибридизацию вступает 1,35~.' присутствующей неповторяюшейся ДНК. Поскольку только одна цепь ДНК транскрибируется с образованием РНК, лишь половина ДНК в принципе может сгнбридизоваться с РНК (другая половина идентична РНК по последовательности оснований). Поэтому мРНК предо~валяет 2,7; всех последовательностей неповторяюшейся ДНК. Собственно неповторяюшаяся ДНК составляет 75 „' генома размером 8,1.10 п.н.
Следовательно, сложность ДНК, соответствующей популяции молекул РНК, соста- азо 400 600 000 1000 1200 яп' Рис. 18.2. При гибридизации избмзка мРНК с неповзоряюпзейся ДНК до достижения насыщения реакция гибридизации обнаруживается, что только небольшая часть ДНК представлена в мРНК. Эпспсрпмпн г прокопала с использованием очищенной нппопторпющпйсп ДНК, несущей рпппопктпвную метку; и прапппсп реапцпп опрппппяпп прппепт метки, включившейся и гибрид. На рисунке приведены пппньж зо гпбрпппзаппк нпппвтарпющейсп ДНК морского ежа Х ригрппазпь с мРНК выделенной пз полисом эмбриона нп сталин гпсгрулы, вляст 0,027 0,75.8,1 10'=1,7 101 п.н.
Популяция молекул РНК представлена препаратом мРНК полисом, средняя длина которой составляет 2000 оснований. Таким образом, общее число различных мРНК составляет 1,7.101/2000= 8500. Это соответствует общему числу генов, экспрессируюшихся в ткани, из которой была выделена мРНК,— из эмбриона морского ежа, находящегося на стадии гаструлы. Аналогичные эксперименты были проведены для большого числа организмов. Для низших эукариот, например дрожжей, общее число экспрессируюшихся генов относительно невелико-около 4000. Для соматических клеток высших эукариот эта величина составляет от 10 000 до 15 000 генов. Так обстоит дело и у позвоночных, и у растений.
Следовательно, общее количество ДНК, представленное в виде мРНК, обычно составляет очень небольшую часть генома, порядка 1 — 2!м Важное исключение составляет мозг млекопитающих, в котором, по-видимому, экспрессируется значительно большее число генов, хотя точно это число не определено. Такие эксперименты можно проводить только с неповторяюшейся ДНК, когда каждая последовательность может гибридизоваться только со считанной с нее мРНК.
Из-за присутствия во фракции умеренно повторяющейся ДНК множества копий идентичных или сходных последовательностей, РНК, транскрибированные с этой ДНК. кроме специфической последовательности, с которой они были считаны, могут гибридизоваться н с другими последовательностями генома. Поэтому при достижении насыщения реакции гибридизации в гибриде может содержаться большое количество дополнительных последовательностей ДНК, что приведет к завышенной оценке числа экспрессируюшнхся генов. Действительно, для того чтобы быть уверенными, что этого не произошло, ДНК, сгнбридизовавшуюся с РНК, обычно выделяют (разру1иая РНК) и затем используют в экспериментах по реассоциации, чтобы убедиться в том, что значение Спг„ действительно соответствует ожидаемому для неповторяюшейся ДНК.
Такой эксперимент называют прямым воспроизведением. Таким образом, число экспрсссируюшихся генов, определенное этим методом, относят к основной массе генов, последовательности которых представлены в неповторяюшейся ДНК. Оценка числа генов по кинетике реакции, определяемой концентрацией РНК Поскольку в реакциях, определяемых концентрацией РНК, РНК находится в избытке по сравнению с ДНК, связывание небольшого количества РНК прн образова- нии гибрида в ходе реакции существенно не изменяет ее концентрации. Это означает, что кинетика реакции васы- шаюшей гибридизации соответствует кинетике реакций первого порядка, описываемой уравнением — па (8) йо так что, когда реакция завершена наполовину и йдйп = = 0,5, 18.
Структурные гены: как они представлены в мРНК 233 Однако величину Кргцз, полученную в реакции насыщающей гибридизации, определяемой концентрацией РНК, нельзя использовать для определения сложности популяции РНК. Причина состоит в том, что различные последовательности РНК присутствуют в разных концентрациях, определяемых уровнем экспрессии соответствующих генов. Это означает, что значение Кр, определенное для всей массы РНК, неприменимо к каждой последовательности в отдельности. В действительности весьма значительная часть всей мРНК обычно представлена всего лишь несколькими типами последовательностей. Эти последовательности очень быстро гибридизуются со всеми комплементарными им последовательностями в ДНК, после чего ход реакции определяется концентрацией оставшихся последовательностей.
Таким образом, реальное количество РНК, определяющее скорость реакции, гораздо меньше измеренного значения К,. Это означает, что измеренное значение Крг, сильно завышено: оно включает большое количество РНК, не участвующей в реакции, поскольку комплементарные ей последовательности очень быстро включаются в состав гибрида. Для использования данных по кинстике гибридизапии, определяемой концентрацией РНК, при оценке сложности был разработан другой метод. Последовательность операций этого метода приведена на рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
