Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 103
Текст из файла (страница 103)
Эксперименты по перекрестной насыщающей гибридизации позволяют определить количество последовательностей, различных для двух популяций мРНК. На ряс. 18.5 в качестве примера приведены данные таких экспериментов с РНК печени и яйцевода цыпленка. При гибридизации препаратов мРНК, выделенных из этих тканей, с неповторяюшейся ДНК насышение реакции достигается, когда в гибридизацию вступают соответственно 2,05 и 1,80;е ДНК.
Если бы две популяции молекул мРНК были представлены только различающимися последовательностями, то вместе они насышали бы 2,05+ о 1,80 = 3,85;~; неповторяюшейся ДНК. Однако реальное значение составляет 2,4~„, что лишь ненамного выше значения, полученного для печени. Таким образом, около 75% последовательностей ДНК, экспрессируюшихся в печени и яйцеводе, одинаковы (хотя, поскольку это эксперимент по насыщающей гибридизации, на основе приведенных данных не ясно, различается ли число копий этих последовательностей в двух тканях). Иными словами, около 12000 генов экспрессируется и в печени, и в яйцеводе, еше около 5000 генов экспрессируется только в печени и около 3000 генов-только в яйцеводе.
Другой способ определения степени перекрывания мРНК в разных тканях начинается с гибридизации мРНК какой-либо ткани с неповторяюшейся ДНК. Вступившую в реакцию ДНК затем выделяют, получая препарат мДНК, в то время как ДНК, не вступившая в гибридизацию, образует препарат о<нулевой» ДНК. Далее полученные препараты ДНК по отдельности гибридизуют с избытком мРНК из какой-либо другой ткани.
Доля сгибридизовавшейся мДНК соответствует доле ге- они представлены в мРНК нов, экспрессируюшихся как во второй, так и в первой ткани. Количество вступившей в гибрилизацию «нулевой» ДНК указывает на число генов, экспрессируюшихся во второй, но не в первой ткани. Эксперименты по перекрестной гибридизации можно также проводить, используя избыток мРНК из одного объекта для реакции с кДНК, полученной на матрице мРНК из другого объекта. Такие эксперименты свидетельствуют о том, что последовательности, представленные большим числом копий в одной ткани, могут не относиться к этому классу в другой ~кани и даже обнаруживаться в классе редких мРНК.
В печени и почках мыши около 90;„' редких мРНК являются обшнми, различия же между этими тканями по числу экспрессируюшихся генов составляют всего 1000-2000 генов. Общий вывод, который можно сделать иа основе нескольких сравнений такого рода, состоит в том, что только около 1О;;; последовательностей мРНК уникальны для клетки. Большая часть последовательностей является общей для многих, возможно, даже для всех типов клеток. На основе этих данных можно предположить, что обший набор экспрессируюшихся генов, насчитывающий у млекопитающих, вероятно, около 10000 генов, по-видимому, обеспечивает осушествление функций, необходимых для клеток всех типов. Иногда гены, обеспечиваюшие осушествление такого рода функций, называют генами «домашнего хозяйства» (попзе)сеер)п8) или конститутивными генами.
Они являются противополо'кностью генов, обеспечиваюших осушествлеиие специализированных функций (например, выполняемых овальбумином или глобином), необходимых только для клеток с определенным фенотипом. Такие гены иногда называют генами «роскоши». Конечно, если принять во внимание все разнообразие фенотипов клеток организма, наверняка обнаружится столько же генов «роскоши», сколько и генов «домашнего хозяйства». И все-таки обшее число генов (по крайней мере относяшихся к уникальной ДНК), повидимому, превышает не более чем, скажем в 2-3 раза число генов «домашнего хозяйства» и находится в пределах от 20000 до 40000. Некоторые специализированные типы клеток могут функционировать при наличии относительно небольшого числа экспрессируюшихся генов.
При детальном исследовании экспрессируюшихся генов морского ежа 5. ригригагиз было обнаружено, что в его ооците содержится около 18000 последовательностей мРНК. В ходе эмбриогенеза число экспрессируюшихся генов уменьшается до 13000 в бластуле, до 8500 — в гаструле и 7000-в плутеусе (личинке). Однако в некоторых тканях взрослого организма — амбулакральной ножке, кишечнике, целомоците — чис- 236 Часть Ч. Строение генома зукариот Глава 19 ИССЛЕДОВАНИЕ ДНК ло экспрессируюшихся генов падает до величины всего лишь 2500-3000, Таким образом, жизнедеятельность этих клеток может подцерживаться путем функционирования менее чем 10000 генов «домашнего хозяйства», необходимых в случае клеток млекопитающих.
Особенно важная чер~а таких клеток-наличие очень значительного перекрывания последовательностей экспрессируюшнхся генов, так что развитие организма осуществляется за счет постепенного уменьшения числа экспрессируюшихся генов. Эксперименты с препаратами мДНК/«нулевая» ДНК показали, что большая часть генов, экспрессируюшихся на поздней стадии, экспрессировалась также и на ранних эмбриональных стадиях.
Возможно даже, что все структурные гены организма Могли ли мы представить себе, что за последние годы методы исследования ДНК получат такое колоссальное развитие. К замечательным методам, с помощью которых в настоящее время можно изучать ДНК, относятся методы создания молекул ДНК путем соединения последовательностей, имеюших совершенно разное происхождение.
Получаемый продукт часто называют рекомбннантной ДНК, а методы (более популярный термин) — генетической инженерией. Эти методы в равной степени применимы к прокариотам и к эукариотам, хотя их возможности особенно очевидны при изучении эукариотических геномов. Используя такие методы, можно выделить и охарактеризовать гены, недоступные для изучения другими способами. В основе этих методов лежит способность ферментов рестрикции (рестриктаз) расщеплять ДНК на отдельные, довольно короткие нуклеотидные последовательности.
В гл. 3 мы уже обсуждали использование рестриктаз для составления физической карты ДНК и получения фрагментов ДНК, нуклеотидная последовательность которых может быть определена непосредственно. Таким образом, если исследователь располагает участком ДНК, соответствующим, например, определенному гену, то определение его нуклеотидной последовательности сейчас уже представляется вполне рутинной, чтобы не сказать рядовой, процедурой. Используя эти данные, с помощью некоторых химических и биохимических методов можно разрывать молекулу ДНК и снова восстанавливать ее целостность практически в любом месте. В этой главе мы рассмотрим первые этапы исследования индивидуальных генов.
Как выделить цнтоплазматическую РНК или геномную ДНК, соответствуюшую определенному гену? Как, идентифицировав такую ДНК, получить ее в достаточном для исследования количестве? Можно ли использовать этот материал для синтеза продукта гена ш И1го илн ш»1»о? Можно ли вносить в полученную последовательность изменения, влияюшие на ее экспрессию н способствующие выяснению природы регуляторных сигналов'! зкспрессируются в ооците, откуда следует, что геном морского ежа состоит из менее чем 20000 генов, кодируюшие последовательности которых составляют только 3; всей ДНК гаплоидного генома. Рекомендуемая литература Подобный обзор работ по определению числа генов содержится в книге Льюина Б. (ье»чл В., Пепе ехргезз1оп, 2, Ецсагуойс йепошез, %йеу, Хев Уог)г, 1980, рр, 694 — 727).
Более ранние экспериментальные данные суммированы в обзоре Льюина Б. (Беий» В., Се!1, 4, 77 — 93, 1975). Любая последовательность ДНК может быть клонирована в бактериях Клонирование фрагмента ДНК позволяет получить любое его количество из одной-единственной молекулы. (Клоном называется большое число клеток или молекул, идентпчных исходной родительской клетке или молекуле). Клонирование ДНК возможно благодаря способности бактериальных плазмид и фагов продолжать нормально функционировать после встраивания в нх геном дополнительных последовательностей ДНК.
Встраивание приводит к образованию гибридных, или химерных, плазмид или фагов, состоящих из ДНК нх собственного генома и дополнительных «чужеродных» последовательностей. Такие гибридные последовательности реплицнруются в бактериях точно так же, как и исходные плазмиды илн фаги, и поэтому могут быть получены в больших количествах. Копии чужеродных фрагментов могут быть затем снова выделены в чистом виде из клеток потомства. Поскольку, за редкими исключениями, отдельные встроенные в геном чужеродные последовательности не влияют на свойства химерных штаммов, практически любая последовательность ДНК может быть клонирована таким способом.
Так как фаг или плазмида обеспечивают «перенос» чужеродной ДНК в качестве нпср~ной части генома, их часто называют клонпруюшнмн векторамн. Основное требование, предъявляемое к клонируюшему вектору, состоит в том, что он должен содержать участок, куда чужеродная ДНК может бьггь встроена без нарушения какой-либо важной функции. Самый простой способ решения этой проблемы — подобрать фермент рестрикции, вносяшнй единственный разрыв в такой участок векторной ДНК. Далее необходимо суметь отделить химерный геном от исходного вектора, так как иначе после клонирования будет трудно выделить химерный геном из всей массы материала.
19. Исследование ДНК 237 Плазмиды †небольш элементы бактерий, реплицирующиеся независимо от бактериальной хромосомы (гл. 31). Геном плазмид всегда представляет собой кольцевую двухцепочечную ДНК и имеет систему контройгя репликацни, которая поддерживает их количество в бактериальной клетке на определенном уровне. Существует два основных типа плазмид. В случае однокоиийных плазмид на хромосому клетки-хозяина приходится 1 молекула плазмидной ДНК.
Мультикопийные плазмиды присутствуют в клетке в большем количестве, обычно составляющем около 10-20 плазмидных геномов на клетку. Некоторые плазмиды находятся под ослабленным контролем репликащйи, в результате чего при прекращении роста бактерий они накапливаются в очень болыпих количествах (- !000 плазмидных геномов на клетку). Такие плазмиды часто используют для получения клонирующих векторов, поскольку они обеспечивают более высокий выход материала. Внесение разрыва в один нз участков кольцевой плазмидной ДНК превращает ее в линейную молекулу, как показано на рие.
19.1. Затем два конца этой молекулы могу~ быть присоединены к концам линейной молекулы чужеродной ДНК, что приводит к образованию кольцевой гибридной плазмиды. Формально не существует ограничений на длину вот.раиваемой в плазмиду чужеродной ДНК. Гибридная плазмида может существовать в бактериальной клетке неограниченно долгое время. Для выделения гибридной плазмиды из клетки, например с помощью гель-электрофореза, можно использовать такие ее свойства, как размер или кольцевое строение. Многие плазмиды несут гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
