Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 102
Текст из файла (страница 102)
18.3. Он включает использование меченой кДНК, полученной на матрипе мРНК в реакции обратной транскрипции. Мы рассмотрим этот метод в гл. 19; все, что необходимо знать сейчас, †э то, что кДНК представляет собой одноцепочечную ДНК, комплементарную мРНК. Реакция гибрзшизации происходит между избытком мРНК и меченой кДНК, предварительно полученной на матрице этой мРНК. Каждая последовательность мРНК представлена в популяции молекул кДНК в количестве, соответствующем ее процентному содержанию в РНК. Поскольку все последовательности кДНК получены на матрице мРНК, вся меченая кДНК должна участвовать в образовании гибридов. Для каждой отдельной последовательности величина Крг„ реакции пропорциональна сложности популяции молекул РНК, аналогично тому как величина Сагыз зависит от сложности генома в реакции реассопиации. Поэтому сложность некоторой популяции молекул РНК может быть определена путем сравнения значения Крг„, со значением Крг, з стандартной реакции.
В качестве стандарта, например, часто используют реакцию избытка глобиновой мРНК с ее кДНК. В этом случае можно составить следующее уравнение; Сложность паобой РНК Сложность глобиновой мРНК К„гцз любой РНК Коцо глобиновой мРНК (10) Это уравнение полностью аналогично уравнению 5 в гл. 17, определяющему сложность препаратов ДНК путем сравнения значений Сагнэ исследуемых и стандартных препаратов ДНК. При использовании Кр1-анализа рассчитанная сложность также соответствует обшей длине различных последовательностей без учета организации индивидуальных последовательностей в геноме. Так же как и в случае кривой реассоциации ДНК, каждый компонент гибридизуется в пределах значений «днк ом РНК О ределе иллроце уа бридиааци ДНК «а«фу ции оу яоу Рис.
18.3 Гибридизацию избытка мРНК с кДНК используют длд определения сложности мРНК. Крг, различаюшихся на два порядка, и для кривой реакции, осушествляюшейся в более широком диапазоне значений этой величины, необходимо применение компьютера, чтобы разложить ее на индивидуальные компоненты. И опять кривая гибридизации отражает существование целого спектра частот встречаемости последовательностей. При определении сложности каждого компонента он рассматривается как единственный в смеси. Для этого измеренное значение Кргьк приводят к значению Кргпз, ожидаемому для чистого компонента: полученное в реакции значение Крг,ы умножают на процент содержания данного компонента в реакционной смеси. Фактически этим корректируется значение Кр так, чтобы оно соответствовало количеству РНК, представленному только рассматриваемым компонентом.
Пример реакции гибридизации избытка мРНК с кДНК, в которой образуются три четко различимые фракции, приведен на рис. 18.4. Контролем в этой реакции служила гибридизация чистой овальбуминовой мРНК (длиной 2000 п.н.) с овальбуминовой кДНК, значение Косца реакции составляло 0,0008. Это означает, что сложности, равной 1000 п. но соответствует значение Крзпз, равное 0,0004. Первый компонент составляет 50% от всей РНК, участвующей в реакции, и значение Коти для него равняется 0,0015. Тогда значение К„г„„соответствующее чистому первому компоненту, составит 0,5 0,0015 = 0,00075, что почти точно совпадает со значением Крг,ц для мРНК овальбумина. Это означает, что первый компонент фактически представляет собой овальбуминовую мРНК! Последнее хорошо согласуется с известными свойствами ткани яйцеводов, где овальбумин действительно явдяется основным продуктом экспрессии генов, и овальбуминовая мРНК составляет около половины всех мРНК клетки.
Для второго компонента значение Ксг„составляет 0,04, и на его долю приходится 15;;, участвуюшей в реакции РНК. Следовательно, значение К„г„з для чистого второго компонента составит 0,15.0,04 = 0,006. Таким образом, его сложность равна 0,006,У0,0004 1000 = 15000 оснований. Это соответствует наличию в составе второго компонента 7 — 8 видов мРНК со средней длиной 2000 оснований. Последний компонент имеет значение К зп„ равное 30, и на его долю приходится 355У, РНК, так что значение 234 Часть с'.
Строение генома эукариот чоо 75 Ф и с г й 50 25 чо-ч чо-з чо-г чо-1 ! го чог йо! Рис. 18.4. Прн «ибрндизацни избытка мРНК с кДНК обнаруживается несколько фракций РНК, каждая из которых характеризуется величиной Кос,ы реакции. Степень гибридизации определястея оо конечному количеству вступившей в реакцию кДНК. Обычна зга величина близки к ! 00",„' и поч~и всегда превышает 90",„'. На рисунке иривслсны данные по гибридизации мРНК, полученной пз яйцевода кур.
Кот,ж, соответствующее чистому компоненту, составляет 0,35 0,30 = 10,5, а его сложность равняется 10,5/0,0004 1000 = 26 000 000 оснований. Это соответствует примерно 13000 видов мРНК со средней длиной 2000 оснований. Такой анализ показывает, что около половины всех мРНК клетки представлено одним видом мРНК, около 15% — не более чем 7 — 8 видами мРНК и около 35, представлечо большим числом (13 000) видов мРНК. Отсюда ясно, что количества мРНК, относящихся к разным компонентам, должны сильно различаться. Уровни экспрессии генов сильно различаются Среднее число молекул каждого вида мРНК, приходящееся на клетку, называется ее копийностью (аЬппс(апсе) илн представленяостью. Эту величину очень просто определить, если известно общее количество РНК в клетке.
Для каждого кинетического компонента (фракцнн) общее количество РНК = Представленность Сложность, поэтому в общем виде уравнение выглялпт следующим образом: Представленность = г мРНК на клетку Доля РНК в компоненте.б.!Озз Сложность компонента в дальтонах (11) Обычно уравнение имеет именно такой вид, поскольку общее количество мРНК, определенное химически, выра- жают в пнкограммах, в то время как сложность (определяемую с помощью гибридизационных методов) выражают в основаниях нли дальтонах.
В примере, приведенном на рис. 18.4, количество мРНК на клетку составляет 0,275 пг. Это соответствует 100 000 копий первого компонента (овальбумиповой мРНК), 4000 копий каждого из 7 — 8 видов мРНК второго компонента и только примерно 5 копиям каждого нз 13000 видов мРНК, входящих в состав третьего компонента. Яйцевод — в некотором роде исключительный случай, когда такое значительное количество мРНК представлено всего лишь одним внлом мРНК. Но и в большинстве других клеток большую часть всех мРНК составляе~ фракция мРНК, представленная всего несколькими видами мРНК. Такая многокопийиая фракция обычно состоит нз менее чем 100 различных видов мРНК, присутствующих в количестве более 1000 илн даже 10 000 копий на клетку.
Она часто включает наиболее значительную часть всей мРНК, составляя до 50;г„ее общего количества. В этой фракции можно выделить два компонента (как в случае яйцевода), или можно считать, что она представляет собой один компонент, однако для активно транскрибируюшихся мРНК каждый соответствующий им ген, повидимому, имеет свой характерный уровень экспрессии, отличающийся от уровней экспрессии других генов. Во всех случаях около половины общего количества мРНК состоит из большого числа последовательностей (порядка 10 000), каждая из которых прелставлеиа только небольшим числом копий, скажем менее 1О. Это класс редких нлн сложных мРНК. (Именно этот класс определяет скорость протекания реакции насыщающей гибридизации.) Оценки общего числа экспрессируюшихся ~снов, полученные методом насыщающей гибридизации и кинетическим методом, обычно хорошо согласуются.
Кинетический метод дает более низкие значения (поскольку некоторые, очень редкие последовательности могут не вступать в гибридизацию.) Метод насыщающей гибридизации дает более высокие значения (поскольку в гибридизации всегда могут участвовать некоторые последовательности, присутствующие в количестве более одной копии на геном). Поэтому для яйцеволов птиц кинетическим методом обнаруживают около 13 000 видов мРНК, в то время как методом насыщающей гибрилизацнн-!5000 видов.
Перекрывание популяций МРНК Число экспрессируюшихся генов во многих соматических клетках высших эукариот колеблется в пределах от 10 000 до 20000. Насколько перекрываются гены, экспрессирующиеся в разных тканях'? Например, в печени цыпленка число экспрессируюшихся генов составляет от 11 000 до 17 000, а в ткани яйцевода, как было только что упомянуто,-от 13 000 до 15 000. Сколько генов из этих двух наборов идентичны? Сколько генов специфичны для каждой тканич Сразу же можно сказать, что, по-внднмому, имеются существенные различия между генами, экспрессируюшимнся с образованием класса мРНК с малым разнообразием видов («многокопнйного» класса).
Овальбумин, например, синтезируется только в яйцеводе и совсем не синтезируется в печени. Это означает. что 50% всей 235 з,о ее ее я г в в г,о й 8 $ * ьо е й о о Пе е вйеевой Пе я йеевой гооо 18. Структурные гены: как Рис. 18.5. Перекрестная васыщающая гибридизация позволяет определизь число различающихся последовательностей, присутствующих в двух препаратах мРНК. мРНК яйцевода специфично для йюй ткани.
Если посмотреть шире, во многих случаях многокопийные мРНК транскрибируются с генов, кодируюшнх белки, которые являются основным продуктом клеток данного типа. Таким образом, могут обнаруживаться существенные различия в количестве мРНК и синтезируемого белка между клетками разных типов. Но многокопийные мРНК неизменно представляют только небольшую часть экспрессируюшихся генов. Что касается общего числа генов организма и различий в транскрипции, которые должны сушествовать между клетками различных типов, то необходимо знать число генов, экспрессируюшихся с образованием классов редких мРНК в клетках с разными фенотипами. Для определения степени перекрывания популяций мРНК в целом не сушествует достаточно чувствительных методов, однако путем модификации методов, используемых для определения сложности популяций, удалось получить некоторые ориентировочные оценки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
