Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 97
Текст из файла (страница 97)
иерее. Часть Ч. Строение генома эукариот сх !!не ! нка реассоциации завис и от !енетической сложности последовательностей Д1-!К Реассоцнация двух комплементарных последовательностей ДНК происходит путем спаривания оснований — в отличие от процесса денатурации, при котором онн разделяются (см.
рис. 2.15). Мы уже рассмотрели многие эксперименты, в основе которых лежит использование этого метод% для выделения индивидуальных последовательностей ДНК или РНК и их способности гибридизоваться со специфическим зондам. Сейчас мы увидим, что кннетика реассоциации отражает разнообразие присутствующих в клетке последовательностей, причем эта реакция может быть использована для определения количества генов и их РНК-продуктов. Такие реакции при их проведении в растворе называются гибридизацией в растворе. Ренатурация ДНК зависит от случайных столкновений комплементарных цепей; таким образом, этот процесс подчиняется кннетике реакций второго порядка.
Это означает, что скорость реакции определяется уравнением сгС = — )сСг, сгс где С вЂ” концентрация одноцепочечной ДНК в момент времени с, а к — константа скорости реассоциацни. Проинтегрировав это уравнение в пределах от исход- ной концентрации ДНК, С„ в момент времени с = О до концентрации молекул С, остающихся одноцепочечными к моменту времени с, протекание реакции можно описать следующим образом: С 1 Со 1+ !с'Сос Таким образом, ко~да реакция прошла наполовину, в момент времени сп, С 1 ! (3) Со 2 ! + )с'Согыг откуда 1 Соссы = lс (4) Реассоциация любой специфической ДНК может быть описана с помощью константы скорости реакции й (моль нуклеотидов ' л.с ') или обратной ей величины Сос,ц (в молях нуклеотидов сссл).
Из этого уравнения следуе~, что основным параметром реакции реассоциации является произведение концентрации ДНК (Со) на время инкубации (с). Эта величина часто обозначается просто как Сос. Аналогичным образом величина, соответствующая осуществлению реакции рсассоциации наполовину, обозначается как Соспг. Большие значения С с„, указывают на более медленное протекание реакции, поскольку эта величина — произведение концентрации на время, необходимое для осуществления реакции наполовнну. Реассоциацию ДНК обычно изображают в виде кривой Сос, где значениям !оп Со! соответствует процентное содержание в смеси фракции реассоцнировавшей ДНК (! — С,сСо).
На Рис. 17.2 пРиведены кРивые Сос длЯ нескольких геномов. Форма кривых одинакова, ренатурация осуществляется в диапазоне изменения значений С с в 100 раз, и кривая располагается между точками, соответствующими 10/,-ной и 90%-ной ренатурацин. Но значения С с в каждом случае сильно разлнчаются, и процесс реассоциации может быть охарактеризован величиной Соспг (значение Сос, соответствующее осуществлению реакции реассоциации на 50ч). Значение Сос, прямо пропорционально количеству ДНК в геноме. Это отражает то обстоятельство, что при увеличении сложности генома уменьшается количество копий каждой специфической последовательности в общей массе ДНК.
Например, если величина Со ДНК составляет 12 пг, то ДНК будет содержать 3000 копий каждой последовательности в случае бактериального генома, размер которого-0004 пг, но лишь 4 копии каждой последовательности, присутствующей в эукариотическом геноме размером 3 пг. Таким образом, при одинаковой абсолютной концентрации ДНК, измеряемой в молях нуклеотидов на литр (Со), концентрация каждой эукариотической последовательности будет в 750 раз (3000сс4) ниже, чем концентрация каждой бактериальной последовательности. Поскольку скорость реассоциации зависит от концентрации комплементарных последовательностей, для достижения одинаковой опсносипеленой концентрации эукариотических и бактериальных последовательностей необходимо иметь в 750 раз больше эукарнотической ДНК (либо инкубировать то же ее количество в 750 раз дольше).
Соответственно Соспг реакции реассоциации в случае эукариотической ДНК в 750 раз больше, чем в случае бактериальной ДНК. Таким образом, величина Сос, реакции указывает на суммарную длину различных присутствующих последовательностей, которая называется сложностью генома (сопср!ех!гу). Обычно эту величину выражают в парах нуклеотидных оснований, но она может быть выражена в дальтонах или любых других единицах массы. При ренатурации ДНК любого генома (или час~и генома) величина Сосьг будет пропорциональна его сложности.
Поэтому сложность любой ДНК можно определить путем сравнения ее величины Сос,д с соответствующим значением стандартной ДНК известной сложности. Обычно в качестве стандарта используют ДНК Е. соИ. Ее сложность принимают равной длине генома (считая, что каждая последовательность генома Е, сой размером 4,2 1Оо п. н. уникальна). Тогда можно написать следующее соотношение: С сгсг (ДНК любого генома) Согпг (ДНК Е. сой) Сложность любого генома 4,2 10о п.н.
Эукариотические гсномы состоят из последовательностей нескольких типов Когда ДНК эукариотического генома характеризуют с помощью кинетики реассоциации, значения Сос реакции обычно находятся в пределах, различающихся на 8 порядков. Это гораздо более широкий диапазон, чем 100-кратный диапазон, которого можно было бы ожидать, исходя из уравнения 2, и который показан на рис. 17.2. Причина состоит в том, что уравнение описы- 17. Геномы эукариот: множество последовательностей 225 1 3500 1,7х!Ое 4,2х10е п.н, в пеноме о й 4 я $ 100% 10-е 10-в Ю Ю' 1Ов 10" 10-410-1 10-7 10хп 1 1 Т Т вх10 э Зх10 ' 9 Сое)З 2х10 в рис.
17 2 Скорость реассосиации обратно пропорциональна длине реассодиирующей ДНК. вает реассоцнацию одного кииетически чистого компонента. В действительности жс в состав генома может входить несколько таких компонентов, каждый из которых характеризуется своей кинетикой. На рис. 17.3 показана реассоциация гипотетического эукариотического генома, начинаюшаяся при значении С г, равном !О ", и заканчивающаяся при значении Со!= 104. В этой реакции можно выделить три фазы, обозначенные на рисунке закрашенными прямоугольниками. Вцдно, что первые две фазы разделяет плато, а вторая и третья слегка перекрываются.
Каждая из этих фаз соответствует определенному кинетическому компоненту генома. Фракцию ДНК, реассоциируюшую первой, называют быстро ренатурируюшей. В приведенном примере она составляет 2537 от всей ДНК и ренатурирует при значениях С„г от 10 до примерно 2.10 ' и значении С„г„,, равном 0,0013. Следующая фракция называется промежуточной. Она составляет 30",х', от всей ДНК и ренатурирует при значениях С01 от примерно 0,2 до 100 и значении Сег,ц, равном 1,9. Фракция.
реассоциируюшая последней, называется медленно реиазурируюшей. Она составляет 45',:„' от всей ДНК и ренатурирует в диапазоне значений Ссг от < 100 ло примерно 10000 при значении Согни равном 630. При определении сложности этих фракций каждую из них следует рассматривать как независимый кинетический компонент, реассоциацию которого сравнивают с реассоциацией стандартной ДНК. Медленно ренатурируюшая фракция составляет 45;х„от всей ДНК, поэтому ес концентрация в реакции реассоциации соответствует 0,45 измеренной величины С„(относяшейся к общему количеству участвующей в реакции ДНК).
Соответственно величина Ср)1,7, относяшаяся только к медленно ренатурируюшей фракции, составляет 0,45 630 = 283. Таким образом, если бы ДНК этой фракции была выделена в виде чистого компонента, свободного от ДНК других фракций„то она ренаэурировала бы при значении Ссг,ы, равном 283. Предположим, что в таких же условиях ДНК Е сод реассоциирует при значении Ссг,ы, равном 4,0. Подставив эти две величины в уравнение 5, мы увидим„ что сложность этой фракции составляет 3,0 1О' п.
н. Ана- логичным образом можно определить, что сложность промежуточной фракпии составляет 6 101 п. нп а сложность быстро ренатурируюшей фракции — только 340 п. и. Этот расчет служит количественным обоснованием нашего утверждения о том, что, чем быстрее компонент реассоциирует, тем ниже его сложность, Наоборот, если мы возьмем три препарата ДНК, каждый из которых содержит уникальную последовательность определенной длины (340 п.нн 6 10' и. н.
н 3 106 и. н. соответственно), и смешаем их в соотношении 25:30:45, то каждый будет ренатурировать в соответствии с уравнением 2, как будто он является единственным компонентом. Кинетика ренатурации всей смеси целиком будет выглядеть так же, как кинетики реиатурации всего генома, приведенная на рис. 17.3, Размер генома можно оценивать по сложности нег)овторяющейся ДНК вЂ” 1ОО о 75 50 8 25 2 10 4 10 з 10 ! 10 ' 1 10 101 10э 104 гое Солернмн е в пеиаме,я! 25 с й Ое ) О 00!З ело ноеве,п.н . 340 Чеопже повырлемооеи1 ЫХ! 000 (калиево во калий ы о 1,9 630 6 0410е 3 О х !оп 350 1 Рис. )7З. При исследовании кинетики реасссдивции эукариоти- ческсй ЛНК в ней обнаруживаются три типа компонентов(обо- значенных эакраелениыми областями).
Сложность медленно ренатурируюшей фракции ДНК соответствует ее размеру. Предположим, что определенное химически содержание ДНК в гаплоидном геноме, реассоциация которого показана на рис. 17.3, составляет 7,0 10' п. н, Тогда 45 х этой величины составят 3,15 1О' п.нп что только ненамного превышает величину 3,0 10' п.нп определенную в соответствии с кинетикой рсассоциации. Действительно, с учетом ошибок измерения каждого из этих двух методов можно утверждать, что значения сложности медленно ренатурируюшей фракции, определяемые как химическим, так и кинетическим методом, одинаковы. Соответствующие величины называются химической сложностью и кинетической сложиосзъю. Совпадение этих величин означает, что медленно ренатурируюшая фракция состоит из неповторяюшихся (уникальных) последовательностей генома: после денатурации кажлая одноцепочечная последовательность может Часть У. Строение генома эукариот й в ю'и х и в % х юй $ в зеп и и 1 зе' 9 Химическая сложность 7'— (6) Кинетическая сложность ия йеп !ей !е" Спппйпчнип ДНК, прпппйппйпппп нп гпппапйный геном рнс ! 7 4 Кинетическая сложность эукариотическнх геномов хорошо коррелируег е их химической сложностью, за исключением полнплоидных гсномов (обозиаченных буквой Р).
ренатурировать только с соответствующей ей комплементарпой последовательностью. Эта часть генома — единственный компонент прокариотической ДНК (о чем свидетельствуют приведенные на рнс. 17.2 примеры и использование ДНК Б, сод в качестве стандарта); этот компонент обычно является наибольшим в эукариотической ДНК. Он называется непевторяющейся (уникальной) ДНК. Кинетическую сложность уникальной ДНК можно использовать для оценки сложности генома в целом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
