Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 98
Текст из файла (страница 98)
В этом случае делают расчет, обратный проведенному ранее. Для примера, рассмотренного на рис. 17.3, сложность неповторяюшейся ДНК составляет 3,0 10 и. н, Если эта фракция уникальна и составляет 45А, генома, то весь геном будет иметь размер 3,0 1Ое/0,45 = 6,6 10п и. н. Этот расчет дает независимую оценку размеров генома, которую можно сравнить с химической сложностью, составляющей в данном случае 7,0 10 п,н.
Фактически в составе каждого эукариотического генома имеется неповторяющаяся ДНК. Единственное исключение — некоторые растения, возникшие в результате полиплоидизации, вследствие которой каждая последовательность оказывается представленной более чем одной копией.
На рис. 17.4 приведена зависимость между размером генома, определенным по кинетике реассоциации неповторяюшейся ДНК, и содержанием ДНК на гаплоидный геном, определенным с помощью химического анализа. Данные хорогпо согласуются. Это подтверждает высказанное выше предположеаие о том, что нецовторяюшаяся ДНК действительно состоит из индивидуальных последовательностей, присутствующих в гсноме в виде только одной копии. Это важный факт в свете существующего парадокса величины С. Наличие неповторяющейся ДНК означает, что геномы болыпих размеров не образуются путем простого увеличения числа копий последовательностей, присутствующих в геномах меньшего размера. В этом случае геномы большего размера вели бы себя как поли- плоидные; как уже было упомянуто, это привело бы к отсутствию неповторяющейся ДНК.
Таким образом, данные по кинетике реассоциации не согласуются с моделями, объясняющими парадоксальные значения величины С в результате простого увеличения числа копий каждого гена в гаплоидном геноме. Это означает, что мы должны объяснять различия в размерах геномов тем, что геномам ббльших размеров действительно присуще большее разнообразие последовательностей. Гепомв! эукариот содержат повторяющиеся последовательности Какова природа фракций, ренатурирующих быстрее, чем неповторяюцгаяся (медленно ренатурирующая) ДНК? В приведенном на рис. 17.3 примере промежуточные последовательности составляют 30",;, генома, что (исходя из химической сложности) должно соответствовать общему количеству материала, равному 0,3 7 10к = = 2,1.10в п.н.
Но значение кинетической сложности составляет только 6.10' п.н. Таким образом, длина уникальной ДНК. соответствующая Спг, з реассоциации, существенно меньше обшей длины ДНК, соответствующей по химическому составу этой фракции. Иными словами, промежуточный компонент ведет себя так, как будто он включает последовательность длиной 6 10' и, н., представленную 350 копиями на геном (поскольку 350 6.10'= 2,1 1О").
После денатурации одиночные цепи каждой из этих копий могут реассоциировать с комплементарными им цепями любой из 350 копий. Это значительно повышает концентрацию последовательностей, участвующих в реакции реассоциации, и объясняет, почему эта фракция ренатурирует при более низких значениях Се!пи Последовательности, представленные в гсноме более чем одной копией, называются повторяющейся ДНК. Количество копий на геном называют частотой повторяемости ((). Формально частота повторяемости выражаешься отношением Сложность н частота повторяемости вместе характеризуют свойства фракций последовательностей генома. Например, если геном состоит из одной послеловательности длиной А п.нп 10 копий последовательности длиной Б п.н.
и 100 копий последовательности длиной В п.нп то его сложность равняется А + Б + В. Частоты повторяемости последовательностей А, Б и В составляют соответственно 1, 1О и 1ОО. Последовательность А- не- повторяющаяся, последовательности Б и  — повторяюпщеся. Фракция повторяющейся ДНК включает все последовательности, частоты повторяемости которых существенно выше, чем 1. На практике неповторяющимися считают последовательности, частота повторяемости которых составляет от 1 до 2. (Последовательность не может быть представлена в гаплоидном геноме нецелое число раз!). Для примера, приведенного на рис. 17.3, уравнение 6 дает величину(; равную 3,1 5.10п/3,0 10' = 1,05. Обычно диапазон значений этой величины для неповторяющейся ДНК реальных геномов составляет от 0,8 до 1,6.
Повторяюгцаяся ДНК любого генома может состоять из нескольких компонентов, но в зависимости от диапа- 17. Геномы эукариот: множество последовательностей 227 зона значений Сег, при которых происходит реассоциация, различают два основных типа повторов. Они примерно соответствуют промежуточной и быстро ренатурируюшей фракциям, изображенным на рнс. 17.3.
Говорят, что промежуточная фракция, обычно ренатурируюшая при значениях Сег в диапазоне от 1О з до значений, соответствующих неповторяющейся ДНК, состоит из умеренно повтораошейся ДНК, а быстро ренатурируюшая (при значениях Ссг менее 10 ) фракция состоит нз высокоповторяющейся ДНК. Высокоповторяющаяся ДНК обязана своим названием очень большому числу копий основной реассоциирующей последовательности. Обычно эта последовательность довольно короткая.
В примере, приведенном на рис. 17.3, быстро ренатурирующая фракция состоит из последовательности длиной только 340 п.н., присутствующей в количестве 500000 копий на геном. Из-за небольшой длины такие последовательности иногда называют простыми последовательностями ДНК (вйпр1е зедиевсе 0%А). Вместо того чтобы проводить описанную выше серию вычислений, частоту повторяемости любого компонента кривой реассоциации можно определить непосредственно путем сравнения с компонентом неповторяющейся ДНК. Зависимость между частотами повторяемости любых двух компонентов одной и той же кривой реассоциации обратно пропорциональна отношению их значений Ссгпз.
Поэтому, если допустить, что неповторяющаяся ДНК действительно уникальна (ее величина 7' равна 1,0), можно написать другое уравнение для определения частоты любого повторяющегося компонента: Свг„з компонента неповторяюшейся ДНК вЂ” (7) Сег,д компонента повторяющейся ДНК К примеру, среднее значение величины (для промежуточного компонента кривой реассоциации, приведенной на рис. 17.3, составляет 630/1,9= 332. (Это значение несколько отличается от значения, вычисленного по уравнению 6 и соответствующего значению ~'для неповторяющейся ДНК, равному 1,05) УМЕРЕННО ИОВТОРЯЮЩВЯСЯ ДНК СОСтОИт ИЗ МНОжЕСтна РаЗЛИЧНЫХ последовательностей Фракция повторяющейся ДНК ведет себя в соответствии с усредненными характеристиками, полезными при описании последовательностей, входящих в ее состав.
Соответствующие параметры не обязательно характеризуют свойства какой-либо определенной последовательности. В состав фракции умеренно повторяющейся ДНК, представленной на рис. !7.3, входит ДНК общей длиной 6 10' п.н., повторенная в геноме около 350 раз. Но эта цифра не соответствует длине целостной, реально существующей, непрерывной ДНК. Напротив, в состав этой фракции входит множество индивидуальных последовательностей, каждая из кэторых намного короче, а общая длина достигает б 10з п.н. Средняя повторяемость этих последовательностей составляет 350, но одни из них представлены большим числом копий, а другие — меньшим.
Прн изучении кинетики реассоцнации ДНК эукариотического генома фракции индивидуальных последовательностей редко разделяются так же хорошо, как это показа- но на рис. 17.3. В действительности они часто слишком сильно перекрываются, чтобы их можно было различить на глаз. На рис. 17.5 приведен пример такого рода. ДНК генома морского ежа 5. ригригагиз ренатурирует в пределах значений Сей различающихся на восемь порядков; при этом видны точки перегиба, разделяющие разные компоненты, но процентное содержание каждого и его Се!из сразу определить нельзя.
Метод, применяемый для идентификации индивидуальных компонентов, основан на использовании программы для ЭВМ, с помощью которой пытаются подобрать индивидуальные кривые (для гипотетических, кинетически однородных фракций) для каждой области кривой реассоциации. Этн индивидуальньш кривые перекрываются и в сумме образуют кривую, отражающую наблюдаемое поведение последовательностей генома. Как отмечалось ранее, если приготовить смесь препаратов ДНК с определенными значениями сложности, ее кривая реассоциации совпадет с экспериментальной кривой для геномной ДНК.
На рис. 17.5 приведен подтверждающий такое заключение пример, где три индивидуальные кривые представляют компоненты, составляющие 19, 27 и 5(У,'~;, всей ДНК (в соответствии со скоростью их реассоциации). В этом случае два первых компонента следует отнести к умеренно повторяющейся ДНК со значениями Сей равными 0,53 и 8,3; эти значения соответствуют сложности, равной 1,0 10 и.
н., повторенных 160 раз, и сложности, равной 2,3 1О" и. н., повторенных !0 раз. Третий компонент кривой — неповторяющаяся ДНК. Обычный подход при компьютерном анализе состоит в поиске минимального числа индивидуальных кинетических компонентов, суммирование кривых реассоциации которых обеспечит достаточно хорошее приближение к экспериментальной кривой. Однако это не обязательно отражает биологическую структуру генома. Часто оказывается возможным получить столь же хорошее приближение и при большем числе компонентов.
Например, данные, приведенные на рис. 17.5, можно также обьяснить наличием трех умеренно повторяющихся компонентов, составляющих 1О, 27 и 25;~ ДНК генома с частотами повторяемости 8000, 240 и 19, Прн таком анализе также получают меньшие значения размеров компонента неповторяющейся ДНК. Реально существующая система может, таким образом, включать множество повторяющихся компонентов, реассоциируюших в диапазоне значений Ссг, значительно (от 10 до 20000 раз) превышающем этот диапазон для не- повторяющегося компонента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
