Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 100
Текст из файла (страница 100)
ковому для иативной ДНК, но Гмассоциировавшая умеренно повторяющаяся ДНК плавятся в пределах широкого температурного интервала. Часть У. Строение генома эукариот 230 Глава 18 СТРУКТУРНЫЕ ГЕНЫ: КАК ОНИ ПРЕДСТАВЛЕНЫ В мРНК Наследование простых признаков по Менделю предполагает существование в гаплоидном геноме единственной копии каждого детерминирующего фактора. Фактор может располагаться в определенном покусе, и самое простое предположение состоит в том, что каждый такой покус представляет собой последовательность ДНК, кодируюшую единственный белок; примером этого служит определение гена, данное в гл. 2. Вот классический взгляд иа структурный ген: уникальный компонент генома — единственная последовательность, кодирующая свой белковый продукт, которую поэтому можно идентифицировать с помощью мутаций, нарушающих функцию белка.
Но имеется также и другой класс генов, существующих в виде множества последовательностей, кодирующих один и тот же белок (или иногда белки, обладающие большим сходством). Такие гены бывает трудно или даже невозможно выявить с помощью мутаций, поскольку инактивация одной из копий гена не нарушит работу остальных.
Генетические данные, таким образом, относятся скорее к генам первого типа, поэтому нам следует обратиться к прямому анализу ДНК генома для определения числа и процентного содержания в геноме уникальных и повторяющихся генов. Для выявления структурных генов н определения их свойств идеальным посредником является мРНК. С одной стороны, белок, которому она соответствует, может быть получен путем ее трансляции.
С другой стороны, гибридизуя мРНК с геномной ДНК, можно выделить ген, с которого она считана. Индивидуальная мРНК служит как бы рукояткой для поворота исследований в обратном направлении: от белка к гену. Набор последовательностей мРНК, обнаруживаемых в полисомах, соответствует полному набору генов, экспрессируюшихся в клетке или ткани. Таким образом, состав популяции мРНК отражает как природу, так и число структурных генов. Используя метод гибридизации нуклеиновых кислот, можно прийти к решению ряда основных вопросов. Сколько существует копий каждого гена? Сколько генов экспрессируется в клетках определенного типа? Какова степень перекрывания наборов генов, экспрессия которых определяет различия между клетками разных типов? Явз;яются ли структурные гены уникальными или повторяющимися? В зависимости от входящих в состав эукариотнческого генома структурных генов можно представить себе три возможных способа его организации.
Структурный ген может быть уникальным и состоять из последовательности ДНК, представляющей в геноме специфический белок н не похожей ни на какую другую последовательность генома. Такая последовательность, несомненно, будет входить в состав фракции неповторяюшейся ДНК. В другом случае структурный ген может быть уникальным в том смысле, что он действительно представляет собой последовательность ДНК, кодирующую специфический белковый продукт, но в гсноме могут присутствовать и другие последовательности, сходные с этим геном и кодируюшие сходные белки. Такая ситуация наблюдается, когда кодирующая последовательность дуплицируется с последующей дивергенцией ее копий и появлением разных белков. В зависимости от степени сходства между последовательностями ДНК, числа копий и точно не предсказуемых последствий ошибок спаривания при реассоциации такие последовательности могуг обнаруживаться во фракциях как неповторяющейся, так и умеренно повторяющейся ДНК.
Еще один возможный способ организации генома эукариот состоит в том, что структурные гены могут повторяться: может существовать более одной копии последовательности, кодируюшей специфический белок. Вследствие вырожденностн генетического кода последовательности ДНК, кодирующие один и тот же белок, в действительности могут быть неидентичными. Однако любая последовательность, представленная небольшим числом копий (более двух или трех), будет вести себя как составная часть фракции умеренно повторяющейся ДНК.
(Понятно, что такие последовательности могут составлять только часть , этой фракции, поскольку известно, что основная часть умеренно повторяющейся ДНК состоит из отдельных последовательностей, слишком коротких, чтобы кодировать белки, и чередующихся с уникальной ДНК.) Исследуя кинетику гибридизации, можно определить число копий каждого гена, соответствующее числу видов мРНК в популяции или числу индивидуальных мРНК. Говоря точнее, такой анализ дает ответ на вопрос: какие последовательности генома, уникальные или повторяющиеся, представлены в мРНК? Поскольку этот метод имеет ограниченную разрешающую способность, структурные гены, обнаруживаемые в составе неповторяющейся ДНК, не обязательно являются уникальными. Они могут быть представлены небольшим числом копий, но это число несомненно должно быть меньше, чем, скажем, три или четыре.
Для определения точного числа копий необходимо выделить ДНК, соответствующую индивидуальным мРНК. Это требует перехода от метода исследования кинетики гибридизации к методам, описанным в следующей главе. Для структурных генов, относящихся к повторяющейся ДНК, частота повторяемости последовательности ДНК позволяет только примерно оценить число генов.
Для определения числа генови их взаимосвязей опять-таки необходимо выделить индивидуальные члены семейства. Свойства повторяющейся ДНК в целом соответствуют свойствам семейств, состоящих из сходных, но не идентичных последовательностей, что, однако, не исключает наличия в составе этой фракции некоторых семейств последовательностей, все члены которых идентичны или обладают очень большим сходством. 18. Структурные гены: как Фни представлены в мРНК 23! Большая часть структурных генов относится к неповторяуощейся ДНК Используя РНК в качестве зонда в эксперименте по рсассоциации, можно определить, какие последовательности генома представлены в мРНК.
Очень небольшос количество радиоактивной РНК (нли ДНК) вносят в реакцию вместе с существенно большим количеством клеточной ДНК. Поскольку ДНК клетки присутствует в огромном избытке, ее часть, образовавшая гибриды с РНК-зондом, не изменит концентрации последовательностей одноцепочечной ДНК. Определяющим фактором реакции является реассоциация комплементарных депей ДНК клетки (т.е, как будто РНК-зонд отсутствует). Такие реакции называют реакциями, определяемыми концентрацией ДНК. Реассоциацию всей ДНК определяют обычными способами (по изменению оптической плотности раствора или по связыванию с !идроксиапатитом).
Степень гибридизации зонда определяют, измеряя радиоактивность двухцепочечных молекул. РНК- (или ДНК-) зонд участвует в реакции так, как если бы он просто входил в состав фракции последовательностей, с которой он транскрибировался. Эту фракцию выявляют, сравнивая кривую гибридизации радиоактивного зонда с кривой реассоциации всей ДНК.
Поэтому значения Сог, при которых гибридизуется мечевая РНК, могут быть использованы для определения частот повторяемости соответствующих последовательностей генома. Когда зондом служит индивидуальная мРНК, она гибридизуется при единственном значении Сагнэ, зависЯщем от частоты повтоРЯемости гена или генов, представляю!цих ее в геноме. Для уникального гена эта величина будет такой же, как для неповторяющейся ДНК, в то время как для повторяющихся генов будет наблюдатьса соотвстствУюшсс Уменьшение значеннЯ Со!из. При использовании популяции молекул мРНК каждая мРНК гибридизуется при определенном значении Сог„, так, что кривая в целом представляет собой сумму кривых гибридизации индивидуальных компонентов.
Такую кривую можно разложить на составляющие ее компоненты так же, как и кривую реассоциации самой ДНК генома. Типичная кривая гибридизапии при использовании популяпии молекул мРНК выгдядит так, как показано на (вк. 18.1. Небольшая часть РНК, обычно !О;„' или меньше, гибриднзуется при значении С г„„характерном для умеренно повторяющихся последовательностей, Основная часть РНК гибридизуется при значениях Сагыз идентичных или очень близких к значениям Сог,ы для уникальной ДНК. Обычно эта часть составляет до 50,';; всей РНК. Какая связь существует между последовательностями мРНК, гнбри, изующимися с неповторяющейся и повторяющейся ДНК1 Такие последовательности могут быть разделены на разные классы (в зависимости от того, какая РНК гибридизуется первой). Это указывает на независимое участие в гибридизации молекул разных классов: один класс соответствует генам, относящимся к неповторяюшейся ДНК, а другой — генам, относящимся к повторяющейся ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
