Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 105
Текст из файла (страница 105)
в том, что сайты узнавания рестриктаз могут находиться в неудобных точках (особенно в случае последовательности чужеродной ДНК). Существует другой метод, позволяющий использовать любой конец ДНК для рекомбинации с плазмидой. Плазмиду разрезают, как описано ранее, ферментом, узнающим единственный сайт в нужном положении, но при этом не обязательно образуются зигзагообразные концы. Затем, используя фермент терминальную траисферазу и предшественник б)АТР, к двум 3'-концам плазмидпой ДНК добавляют фрагмент ро1у(г)А). Аналогичным образом присоединяют ро1у(дТ) к 3'-концам молекулы чужеродной ДНК, которую нужно встроить; эти концы мо- тут быть получены любым удобным способом.
Как показано на рис. 19.4, ро!у(с)А) плазмилы может реассоциировать только с ро!у(с)Т) встраиваемого фрагмента. Таким образом, в этом случае возможно осуществление только олной реакции: встраивания одного чужеродного фрагмента в вектор. Недостаток этого метода состоит в сложности выделения встроенного фрагмента из клонированной химерной плазмиды, поскольку в исходном векторе после встраивания чужеродной ДНК не стало сайта узнавания рестриктазой.
Встроенная последовательность с каждой стороны окружена участками спаренных последовательностей ро!у(б)А): ро1у(с)Т). При этом методе мокнут исполь- Часть У. Строение генома эукарнот 240 Пеаз едкий доктор Разрезание со одномт сай у Искадний ни еымй фраз ДНХ Приаоеди е недда к Зск нцам Присо д нан едТе я' цм ТТТТТТ Химернен а амид зоваться также и последовательности ро!у)е)С) н ро1у!т%). Преимущество использования этих последовательностей состоит в том, что при расщеплении плазмнды рестрнктазой Рзг) присоединение ро!у(с)С): ро13(дО) приводит к восстановлению сайта рестрикции для РР41 по обе стороны от встроенного фрагмента.
Дру! ой удобный метод — «сщнванне» (лигировазтие) тупых концов. В его основе лежит способность ДНК-лнгазы фага Т4 сшивать две молекулы ДНК, имеющие тупые концы, то есть молекулы, у которых отсутствуют выступающие одноцепочечные участки. !Эта реакция — дополнительное проявление активности 4жрмента помимо сшивания разорванных связей внутри двухцепочечной молекулы.) Сщивание тупых концов приводит к непосред- Ряс. 19.4, Метод концевого прнсоелинеяпя последовательностей ро!у1дА:т!Т) позволяет «сшять» лве молекулы ДНК путем прнсоелннепня ро!у1с!А) к Зсконпам одной молекулы я Ро!у1е!Т) -к 3сконцам другой.
ственному соединению фрагментов, образованных при расщеплении ДНК рестриктазой, разрезающей обе цепи ДНК поперек в одной точке. Болыпое преимущество этого метода состоит в том, что может быть «сщита» лк>бая пара концов независимо от их нуклеотндной последовательности. Метод особенно полезеа, когда мы хотим сшить две определенные последовательности без встраивания между ними какого-либо дополнительного материала. Трудности, возникающие при использовании этого метода, связаны с отсутствием контроля над сшиванием определенных пар тупых коннов, поэтому необходимо сначала провести реакцию сшивания, а затем отделить нужныс продукты реакции от других ее продуктов. Существует множество вариаций этих методов. 19.
Исследование ДНК 24! В одном методе используют короткие двухцепочечные молекулы ДНК (<шинкеры»), содержащие палиндром, узнаваемый Есой! (или аналогичной рестриктазой). Такие линкеры могут быть синтезированы химически и затем ковалентно присоединены к концам плазмиды или встраиваемого фрагмента путем сшивания тупых концов. Это позволяет затем выделить встроенную ДНК с помошью расщепления рестриктазой Есоц(, но без наложения ограничений на исходный выбор сайтов рестрикции, используемых для создания концов. В настоящее время имеется достаточное число методик, позволяюших встраивать любой фрагмент чужеродной ДНК в любой специфический сайт вектора и при необходимости выделять этот фрагмент в чистом виде. у Фрагмент чужеродной ДНК может быть встроен в'плазмиду в любой ориентации, т.е. любой его конец может быть соединен с любым концом плазмиды.
Это не имеет значения, когда цель клонирования состоит просто в амплнфикации встроенной последовательности, Однако ее ориентация может оказаться существенной, когда эксперимент проводится с целью получения экспрессии чужеродной ДНК. В этом случае в результате случайных встраиваний могут быть получены популяции плазмид, ориентированных н в том, и в другом направлении, после чего путем рестрикциоиного картирования выявляется нужный класс. Можно также провести эксперимент таким образом, чтобы встраивание осуществлялось только в одной ориентации. Например, обе ДНК, векторная и встраиваемая, могут быть разрезаны двумя рестриктазами, образующими разные липкие концы, так что каждая молекула ДНК будет иметь такую структуру: Конец 2 Конец 1 В этом случае, если реассоциировать могут только две концевые последовательности, образующие конец 1, и только две последовательности, образуюшне конец 2, встраивание будет происходить только в одном направлейии с образованием химерной плазмиды: Встроенный КОНЕЦ 1 — фрагмент — Конец 2 Конец 1 — Плбзмнда — Конец 2 Встроенный фрагмент замещает утерянный участок исходной плазмиды, находившийся между сайтамн, рестрикция которых привела к образованию конца ! и конца 2 Получение ДНК-копий на матрице мРНК Идеальный подход для получения последовательности ДНК, соответствуюшей индивидуальному белку, состоит в том, чтобы в качестве отправной точки использовать мРНК, которая, в конце концов, служит матрицей для синтеза белка ш Иуо.
Синтез двухцепочечной ДНК на матрице мРНК оказывается возможным благодаря обратной транскрипции. Ее особенно легко осушествить для мРНК, имеюших ро!у(А)-последовательность на Зчконце, как показано на рис. 19.5. Прежде всего ро1у(А) гибридизуют с затравкой (праймером). Это короткая последовательность о!(йо(дт), пред- 16- Нбт з мрНК мщп Гнбрндизац я е праймером залез ттттт„ Синтез ДНК копни обрат ои транекрилтазой Конец кДНК мтнбаетоя, образуя шпил ку ~/~~~ЯКД~~~~~~)(~д~5Я~~'ЪД~~~7~~Я~Я(тату'„ Обработка щепачаю дпн удалении РНК пттт„ Нополщование ДН К.пол нмерщм дпн доетрвивания шпилаки е образованием комнламентврной цел Сябобм'ЬбЬ~ЪЪад~ММММ~.
Тт, Обработка нуклеазои Я, раощаплнюще шпнлчку МММОбЬХЮ~Юб0~УФЯ~Жб(~~б(ЮСттттт„ Двулцепочвчная дНК-колия нокодной мрНК Рнс. !9.5 На мРНК может быть свнтезврована комплементар- най ей двухцепочечная ДНК. назначенная для создания свободного 3'-конца, который может быть достроен ферментом обратной транскриптазой. (Как и другие ферменты, синтезирующие ДНК, обратная транскриптаза не может начать синтез полинуклеотидной цепи без наличия праймера.) Фермент осушествляет обычный синтез в направлении 5' — 3', добавляя дезоксинуклеотиды по одному; процесс происходит путем комплементарного спаривания оснований с мРНК- матрицей. Продукт реакции — гибридная молекула, состояшая из цепи РНК-матрицы, спаренной с комплементарной цепью ДНК. Единственная практическая трудность при проведении этой реакции заключается в том, что (п вито обратная транскриптаза может останавливаться в разных точках до достижения 5чконца мРНК. Образуюшийся при этом обратный транскрипт оказывается укороченным и соответствует только части молекулы мРНК, поскольку он лишен некоторых последовательностей, комплементарных 5'-концу.
Однако прн подборе оптимальных условий эксперимента нередко удается добиться полного считывания матрицы обратной транскриптазой. Обратную транскрипцию часто завершает полезная реакция. Достигнув конца мРНК, фермент может образовать петлю на конце синтезируемой цепи ДНК, используя несколько последних оснований обратного транскрипта в качестве матрицы для синтеза комплементарного участка. Иными словами, конец комплементарной ДНК используется для прямого синтеза короткой последовательности, идентичной концевому участку мРНК и замешаюшей его.
Это приводит к образованию на 3'-конце обратного транскрипта короткой «шпильки» длиной обычно !0-20 п.н. На этой стадии мРНК-матрицу разрушаю~ обработкой шелочью (на ДНК шелочь не влияет). В результате образуется одноцепочечная ДНК, комплементарная мРНК; она называется кДНК. Шпилька на ее Зчконце служит естественным праймером для следующего этапа-использования фермента ДНК-полимеразы 1 Е сой для превращения одноцепочечной кДНК в двухцепочеч- 242 Часть У. Строение генома эукариот вшихс зное ед м р.ф з. Пнз без ал Вмдвлеи е из исходиоса всзраз оса сели зхвиввлеи имх фрз меи ов дня длн их исследоввнин теза после инъекции РНК в ооциты ксенопуса.
Эффективный метод выделения ДНК, комплементарной мРНК,— трансляция, подавляемая гибридом; в основе метода лежит способность кДНК иодавллнзь трансляцию мРНК, гибридизуясь с ней, в результате чего продукт реакции исчезает из системы трансляции )п т(гго. Ранее сама мРНК использовалась в качестве зонда для выделения генов. Этот метод имел ряд практических недостатков, мРНК никогда не бывает абсолютно чистой, н ее трудно получить в достаточном количестве.
Действительно, метод хорошо подходит ддя выделения генов, мРНК которых представлены большим числом копий, но не может быть использован в случае слабо экспрессирующихся генов. Другая трудность состоит в том, что часто не удается получить мРНК с достаточно высокой радиоактивной меткой. Поэтому вместо мРНК в качестве зонда стали использовать клонированную кДНК-копию мРНК. С помощью уже описанных ранее методов могут быть получены большие количества очищенного материала.
Этот материал может быть помечен (п И!го с получением очень высокой специфической радиоактивности. Первый шаг при идентификации гена, соответствующего специфическому зонду, состоит в дроблении ДНК генома на фрагменты удобного для работы размера. Желательно, чтобы ген находился в как можно меньшем количестве фрагментов (в идеальном случае — только в одном). Обычно максимальная длина фрагментов генома, с которыми можно работать, находится в пределах 15-20 т.п.н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
