Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 109
Текст из файла (страница 109)
Она имеет внд двухцепочечной петли большей толщины, выступающей из области РНК вЂ” ДНК-гибрида. Последовательности ДНК, замененныо иа РНК, образуют Одноцепочечные петли, соответствующие Отдельаым участкам, кодирующим РНК. мРНК гибридизовалась с последовательностью или последовательностями, отстоявшими гораздо дальше от этого участка. Для аденовируса показано (рис. 20.6), что 5'-конец поздней мРНК действительно образуется в результате объединения трех очень коротких последовательностей РНК, соответствующих далеко отстоящим участкам вирусного генома. В этом примере состоящий из трех частей 5'-участок соответствует нетранслируемой лидерной последовательности, в то время как ходирующая область представлена основной частью мРНК.
На рис. 20.7 приведены данные электронной микроскопии по организации вирусного генома. Строение показанного там гибрида указывает на то, что при наличии нескольких промежуточных последовательностей структуры на микрофотографии становятся запутанными и сложными для интерпретации. Электронно-микроскопическое картирование имеет хорошую разрешающую способность в диапазоне примерно 50 — 100 п.но в,зависимости от условий. Участки меньше~о размера на электронно-микроскопической карте могут отсутствовать. Рестрикционное картирование прерывистых генов Рестрикционное картирование как мРНК, так и геномной ДНК наиболее легко осуществить, используя клонированные последовательности. Разумеется, при ра- боте с мРНК необходимо в качестве ДНК-субстрата использовать клонированную кДНК.
Работая с геном, можно использовать и другой способ — прямое расщепление геномной ДНК. Независимо от используемого материала наличие в гене последовательности, не входящей в состав соответствующей мРНК (КДНК), можно обнаружить одним нз двух способов. На рис.
20.0 показано, что если промежуточная последовательность не содержит сайта узнавания нн для одной используемой рестриктазы, длина соответствующего фрагмента изменяется. Наличие интрона означает, что между двумя сайтами рестрикции, расположенными по обе стороны от него, имеется большее расстояние в гене, чем в мРНК. Поэтому и длина соответствующего фрагмента в расщепленном рестриктазой гене увеличивается. С другой стороны, если в промежуточной последовательности имеется сайт узнавания фермента, в него вносится дополнительный разрыв. Поскольку этот разрыв вносится только в ген, но не в последовательность мРНК, то при расщеплении гена получаются два фрагмента вместо одного, образовавшегося из мРНК. Это показано на рис. 20.9. Нри картированяи К-петель ))шю"-глобинового гека мыши обнаруживается длинная промежуточная последовательность.
Наверху приведена электронная микрофотография, а под ией — объясняющий ее рисунок. Фототрвфял любезно предоставлена Ръйр Гойет 249 20. Структурные гены: внутренняя организация Рис. 20.6. Поздняя мРНК аденовируса образуется путем удаления трех промежуточных последовательностей В верхней части рисунка показана структура вирусного генома с промежуточными псслслователыюстями А, В и С, которые удаляются из РНК. На располопенной ниве схеме приведен результат п[бридизапин мРНК с одноцепочсчной ДНК, когда образуются участки гибридов, вытесняющие три сдноцепочечныс петли ДНК. А В С еотзсхзхт[км[мх~[зр[юхту[зсхя[ззчя[ххсьсх! ъзх ' ["'озужтотзстзссоч т[хчд, зрхярхтсхтз!Вос[дкючд~яя~ф днк ! [ 1 [ [ [. Г з ! ф Ф ф Ф С В л дик В2Л=...............г дик[пик Рис.
20.7. Одна из оригинальных электронных микрофотографий гибридизации РНК с одноцепочечной ДНК аденовируса, выявляющей мозаичную структуру транскрипционной единицы поздних генов. Фотография любезно предоставлена РЬ[йр ЗЬагр пнк Прн картированин с использованием нескольких рестриктаз могут быть получены результаты и того, и другого типа. Разрывы, вносимые олннми ферментами, не попадают в промежуточную последовательность; тогда длина соответствующих фрагментов увеличивается. Прн использовании других ферментов из той же промежуточной последовательности будут образовываться дополнительные фрагменты.
Объединяя вместе эти данные, мы видим, что при создании полной рестрикционной карты гена„ содержащего интроны, карта каждого конца гена соответствует карте каждого конца последовательности мРНК. Но в некоторой точке внутри гена карты различаются; там имеется дополнительная область, содержащая ряд сайгон узнавания, отсутствующих в мРНК. Разрешающая способносгь метода рестрикционного картирования позволяет обнаруживать участки гена размером до 20 — 30 п.н. На рис.
20.10 приведено сравнение рестрикционных карт )3-глобинового гена и глобиновой мРНК. При этом обнаруживаются два интрона. Интрон большего размера совпадает с интроном. обнаруженным с помощью электронной микроскопии и показанным на рис. 2021 Меньший интрон присутствует только на рес~рикционной карте. Полезный метод исследования прерывистых генов состоит в изучении свойств гибридов, образованных между мРНК и ДНК, как это показано на рис. 20.11. Помимо гибридных РНК вЂ” ДНК-участков молекула содержит рас- положенные по бокам от них (фланкирующие) участки одноцепочечной ДНК и вытесненные одноцепочечные интроны.
Существует два способа обрабоп[и молекул. Фланкирующую ДНК можно удалить обработкой экзонуклеазой т"з1. Затем с помощью щелочного гидролиза РНК легко выделить одноцепочечную ДНК, по длине соответствующую самому гену. Отдельные участки гена можно выделить обработкой нуклеазой Я, ферментом, специфически расшепляюшим любую одиоцепочечную ДНК, включая даже очень короткие одноцепочечные разрывы в двухцепочечной молекуле. В результате такой обработки удаляются фланкирующие области и интрон.
Продукт реакции — РНК вЂ” ДНК-гибрид, по длине равный мРНК, с разрывом, нарушающим ковалентную непрерывность одной из цепей ДНК. РНК удачяют обработкой щелочью, в результате образуются индивидуальные фрагменты ДНК. Они соответствуют отдельным экзонам гена. В таком виде, как это показано на рисунке, метод известен как нкартирование методом Берка — Шарпагу, по имени его авторов. В более общем виде он известен как картирование с помощью нуклеазы 81. Свойство этого фермента разрушать все связи в неспаренных участках ДНК оказывается очень полезным.
Оно часто используется лля локализации конца последовательности РНК на соответствующем участке ДНК. Например, ДНК гибридизуют с РНК и затем для удаления фланкирующих Часть з!. Строение генома эукариот 250 Раащзнльниа гьиь Рвсщеидзиие гена Рващьнленнь иДНК Рщщ ьии иДНК В«узвжна аасиздавьтедьнаст Встзваьнан аасльдавзтелмьасв (ни!ран! ЖОцбтьОЕОьтгэСОЕОььОЮ~'.ОтзраОШОбббО оботзсчобочоео(яхт)чохсчооохтом2охш очэххбооцочосоцожоооч Т" 'Т" Т' 'Т ' 1' Гель злеитрофарез (фрзн е тм маиьшега размера аблздзюг баньнюл подвижностью! Элеиграфарзз +';Ф иьи, с ф.' ! — — — — — Д2 ' ъа, зуай ц".з М! "" ' — — — — — — в — — — — — — фнм — — — — — — с — — — — — — юв!й При расщеплении нДНК образую!си фрагмеам В и С, дв !и!низ иа размеру, иа змеею аднага бзььгмньгзл.
абразующзгаси в случае иДнк, в слу зь гьнз абрззуютсн дез фрьниеитз, Я! и Яз, лааиаль у да али тзл иь асад!рестрикции рзанадажн! внутри ил!рань .г';.': Рьшри илии гьнз и «дн к. илшгьниы с) .:," аа размеру, на бцьаниенг д, ладу!енина нри рзстрииции гьнз. «мает Гюдьшиа размер рис. 208 При наличии интроиа между двумя сайгами рсстрикпии размер соответствующею рсстрикта увеличивается.
На рисунке приведена сравнение гана н кДНК, имеющих два сайта рестрикции. Прн рестрикции образуются трн фрагмента, обозначенные «ак А, В н С е порядке уменьшения нх размера. Промежуточная последовательность располагается мсжду двумя сайтамн, рестрикция которых приводит к образованию фрагмента А, поэтому этот фрагмент имеет больший размер н случае рестрикции гена.
Рис. 20тф Наличие нставочной последовательности приводит к образованию дополнительных рсстрнктов В том случае, когда она содержит сайт рестрикции для специфического фермента. Наличие дополнительного сайта рестрнкдни в гене привалит к увеличению числа вносимых разрывов ло трех вместо двух, обнаруживаемых в случае кДНК. Поэтому вмсато фрагмента А, образующегося при рестрикции кДНК, прн рестрикции геномной ДНК получаются фрагменты А! н А2. Суммарный размер А! + А2 превышает размер А на длину вставочной последовательности.
участков используют нуклеазу Б1. Тогда участок ДНК оканчивается ~очно в точке, соответствуюшей концу молекулы РНК (как было показано на рис. 11.2). При сравнении нуклеотидных последовательностей такого фра!.- мента ДНК и исходной ДНК можно точно установить местоположение начала мРНК. зуются два (нли более) фрагмента, гибридизуюшиеся с мРНК2 Одна из возможностей заключается в том, что в геноме имеется более одной копии гена, соответствуюшего мРНК. !Копии не обязательно должны быть идентичными, они просто могут обладать достаточным сходством, чтобы гибридизоваться друг с другом.) В этом случае нуклеотидные последовательности по обе стороны от каждой копии могут различаться, так что сайты рестрикции будут располагаться случайным образом по отношению к гену.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
