Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 110
Текст из файла (страница 110)
Тогда все копии будут выделены в виде фрагментов рестрикции разных размеров. Характеристика фрагментов геномной ДНК При расщеплении ДНК генома рестриктазой, не разрезаюшей специфическую последовательность, соответствуюшую мРНК, разрывы вносятся по обе стороны от гена. Сами по себе такие разрывы приводят к образованию одного фрагмента. Какой же вывод можно сделать, когда в таком эксперименте в действительности обра- д(ь ! з.в н! наел Взр дю! Взр 1~ Взр Взр Мжбдыпэьф "ЩАЛШВ *'Вт.ети Цдд ''Х* /ф ! ! ! (((ф (((, (((! / ! ! ! ( ((!! / ( ! ! (((( / ! / / / / !Иитран ! ! ! ! (! Ннграи ( / / ' ! ! ! (П /Г й ( " Зщоц-::,ГЭ.
ВЦ!С" ! Ст Ль - -, (., О ьу!Аа а Ому ".;: —::-::,:, -,. " .." «,:. Е,, а ! ! Г " тм имй нюси н(ьап! ' '' " "гарди! рнс. 20АО. При сравнении рестрикционных карт кДНК и гс- имеются два дополнительных участка, отсутствуюшис н кдНК. помпой ДНК !1-глобина мыши обнаруживается, что н гене Другие области кднк н гена полностью совпадают. 20. Структурные гены: внутренняя организация Экзои -1 И»трон Э зо -2 рваеазачЧ!Чазаеаетъят таоамза2тргата2ачетт;т:.Ю пжаыттттачаатъазаиам ! 1 25! иРНК 2.
о. Ерид ЛИК РИК Иуклезза 21 1 Экзонукпезза Ча моастхурье зцатр "'етхтттх тат 1 Шелочнаа !до'редаци» !дик ! 1 1 1 1 1 1 Электрофорез Электрофорез рдур Экзо -1+ И»тра + Экзо .2 ти!т11 ВВтй Экзо».2 уж-:- ало Экзон-1 .0»теи ч= „Рт Экзо».1+2 ю нуклеазы $1 позван зкзонов. тапачтазатЗРЗтЧаттрттрюж'тнтт22аз2тт 1 1 ! и! Щелочна» 1 детрздацип рнк Рис.
20.11. Метод картирования с помощь лает определить длину как иитронов, так Другая возможность состоит в том, что в состав гена входит промежуточная последовательность !или последовательности), имеющая сайт узнавания рестриктазы. Действительно, наличие каждого интрона, содержащего такой сайт, приведет к образованию дополнительного фрагмента. !Противоположный результат, когда получают один фрагмент, не доказывает отсутствия промежуточной последовательности, поскольку интрон не обязательно содержит сайт рестрикции. Это также не исключает возможности существования небольшого числа расположенных рядом копий.) Как же определить, имеем ли мы дело с множеством копий одного гена или с прерывистым геном? Обычно для решения этой проблемы используют зонды, полученные из субклонов, содержащих последовательности, соответствующие только определенным областям мРНК.
Такие последовательности получают путем разрезания клонированной кДНК на 5'- и 3'-области подходящей рестриктазой 1т.е. такой, которая вносит разрыв в нужное место последовательности, соответствующей мРНК.) Затем такие специфичные по отношению к концам РНК зонды по отдельности повторно клонируют в других плазмидах. На рнс. 20.12 показано, что если два фрагмента — разные копии одного гена, то каждый из них будет содержать его полную последовательность, а значит, оба фрагмента будут гнбридизоваться с зондами, специфичными и для 5'-, и для 3'-концов, На рис.
20Л3 показано, что если два фрагмента генома представляют собой разные участки одного гена, образовавшиеся при внесении разрыва в интрон, то один из них будет гибридизоваться с кДНК-зондом для 5'-конца, а другой-с зондом для 3'-конца. Как при получении фрагментов прерывистого гена можно быть уверенным в том, что обнаружены все интроны н все зкзоны? Структуру гена устанавливают анализом нерекрыеаюи)икся фрагментов, соответствующих различным его областям. Это общий принцип рестрикционного картирования и определения последовательности ДНК !описанных в гл. 3), и верояпюсть пропуска части гена в данном случае будет исключена. Предположим, например, что ген содержит интрон, имеющий два сайта рестрикции для некоторого фермента, как показано на рис. 20.14.
При разрезании гена по этим сайтам два фрагмента — левый 1А) н правый (В) — будут состоять частично из последовательности, представ- Часть 3). Строение генома эукариот 252 Ген 1 Геи г 5' конец 3' наны бч«анец Зч щец ззочжйохчуббт!Озсоаоозсбсх м- — Еж зсосцдчкзрчбобчочзуеахьоцре Расщепление гена он отрннтаюй Т Т Обрабаг«а рщюингюай, не рмщеплнющы «Днк, н юе«глабюрез; наелифннаци» фрагмелоа путем ибрилнзацннсза деми Эле трафарез а геле! де и ф «ац н фра ментаа путем гнбрне зинни с «ДНК г г йзегм .' и ге ! емче тит)' Обе «алин гене нмиаг н 5ч и ; и "' 3' концы и пазгаму гибрид«. чфте -Я зуюгсл со специфн н ми по а!ноше ю ««анцам валаам« Рис.
2ц32. При расщеплении ДНК генома рестриктизой, нс вносящей разрывов и кДНК, и случае поиторяюшихся геаои образуется миожсстио иитактаых копий При расщеплении леул идентичных генов, содержащих 5ь и Зцконцеиыс участки. образуются различающиеся фрагменты, поскольку сайты рестрикции находятся а различпыл участках фланкирующей ДНК. Фрагменты идентифицируют с помощью блоттинга ДНК после злектрофорсза и гибридизации ее с меченой кДНК-зондом. Так как еажлый фрагмент иключаст оба конца гена, он гибридизустся с кДНК-зондами, специфичными по отношению как к 5'и так и к 3цконцсиым послсдоиательностям.
бсгаасчнан щюпедааа- 5' «снцееай тель«ость Эч анц аой участок (интран! у ас а Разрезание реагрингаюй, не анасищей разрмаа» а ДНК Эле«графорез Иде тнфинация фрагментое пущм гибриднзац и с зондами 1 Гибриднзуюгся Один йща мент * цеюй ндНК гнбриднзуегся с 5ч«анцом «ДНК иа л3 Один Фрагмент гибрндизуется с Зчнонцом «ДНК )зона! ййж ЗМИ. При обработке ДНК генома рестриктазой, пе вносящей разрывов и кДНК, из одного гена с интроиом (интроиами) может образоваться несколько фрагментов. Если фермент вносит разрыв и интрон, образуютая лиа фрагмента, которые могут гибридизоиаться с меченой кДНК-зондом.
Но при использоеании зондоа, специфичных по отношению к 5ь и 3цкоицам, каждый фрагмент гибридизуетсл только с одним зондом. Гнбрнлнзацин Гнбрнлнзация Гнбр дизации с целой «ДНК с бч«лицам с Зч«снцам «днк ! д! Днк (ю ы Фре менте Ль в1 С л~+ф -е Обефрзгменга я ни. включают щ облааги, апасабнме В еиуг'й .е гнбрндизоаатм» а «ДНК ;.'О; Эдась дал ен бить располаже фраг ент С,иоан«сандал, пчю«апь«у преистаалнег собой -,з', ни!ран, не гибрид сующийся с «дни Рис.
20 34. При пыяилснии фрагментов генома путем гибриди- зации с кДНК или мРНК могут быть пс обнаружены участки иитроиои, находящиеся между двумя сайтами рестрикции. ленной в мРНК, и частично из ннтрона. Наличие первого компонента делает возможной гибридизацию обшнх фрагментов с зондом, комплементарным мРНК. Однако центральный компонент (С) состоит только нз интронов. Поскольку а его состав не входит последовательность, соответствующая мРНК, он с зондом не гнбрндизуется. Поэтому фрагмент С не будет обнаружен среди последоаательностей, полученных прн рестрикции ДНК данным ферментом.
Такого рода случайности можно избежать, используя несколько ферментов и составляя карту таким образом, чтобы меаио соединении каждой пары соседних фрагментов еакзюв было бы целиком представлено в каком-либо другом фрагменте. Этот метод может включать использование а качестве зондов участков ннтрОНОВ. В конечном итоге сравнение нуклеотидных последовательностей гена и клона кДНК точно выявляет местоположение и размер промежуточных последовательностей. Такой анализ на уровне последоиательностей необходим, прежде чем мы сможем быть уверенными и том, что выявлены все участки гена.
Действительно, и ряде случаев было неожиданно обнаружено, что геномная нуклеотилная последовательность содержит дополнительный короткий кодирующий участок. Когда кодирующий участок имеет длину менее 50 п.нн он может не гибрнлизоваться с кДНК-зондом и поэтому, попадая внутрь находящейся справа или слева от гена промежуточной последовательности, остаться незамеченным. Гены имеют самое разнообразное строение и размеры В настоящее время не существует единой схемы или объяснения существования многообразия структур эукариотнческих генов. Некоторые гены не прерываются, и в этом случае нуклеотидные последовательности генома колинеарны последовательностям мРНК.
Сейчас считают, что большинство генов имеет прерывистое строе- 20. Структурные гены: внутренняя организация 253 РНК.тра скрипт Конц экзонов, приап мвннмв прут лрату Ннтрон т далпепм, н концм экзанае саединнютс» друз с друзам мРНК Н р 2 Э зона ШЗ-604 216 255 аминокислотам 105-катца полнпептнднит цепи в в Зснетранслнруемой области эмина ювслот ам Зз-НН ние, но вставочные последовательности очень сильно различаются как по числу, так и по размерам. Некоторые основные черты характерны для всех прерывистых генов. Порядок расположения участков в прерывистом гене совпадает с их расположением в зрелом РНК-продукте. Поэтому гены являются скорее расщепленными, чем разбросанными. Интроны ядерных генов во всех рамках считывания обычно имеют терминирующие кодоны и поэтому не могут кодировать полипептиды.
Прерывистые гены сохраняют одинаковую структуру во всех тканях, включая половые н соматические клетки, где эти гены экспрессируются или не экспрессируются. Тахим образом, наличие вставочной последовательности-постоянное свойство гена. Все хлассы генов могут иметь прерывистое строение: все гены, кодирующие белки, а также гены, коднрующне рРНК, и гены, кодируюгцие тРНК. Интроны обнаружены также в митохондриальных генах дрожжей и хлоропластных генах. Прерывистые гены, по-виднмому, присутствуют в клетках эукарнот всех классов, хотя их содержание варьирует. Например, их доля среди ядерных структурных генов позвоночных может превышать таковую у грибов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
