Льюин (Левин) - Гены - 1987 (947308), страница 108
Текст из файла (страница 108)
18). Одно из предположений, позволяющих найти выход Часть Ч. Строение генома эукариот из этой ситуации, состоит в том, что значительная часть (даже большинство) последовательностей ДНК не относится к структурным генам. Вопросы о количестве такой ДНК и функциях, ею осуществляемых (или не осуществляемых), предстоит выяснить. В соответствии с другой гипотезой, структурный ген или по крайней мере транскрипционная единица имеет гораздо больший размер, чем последовательность, представленная в виде мРНК. Это предположение косвенно подтверждается данными о том, что РНК, обнаруживаемая в ядре (у высших эукариот), имеет значительно больший размер, чем мРНК. Ббльшая часть избыточной длины РНК должна удаляться при процессинге РНК перед ее транспортом в цитоплазму.
Первоначально было выдвинуто предположение о том, что единица транскрипции может содержать протяженные последовательности, находяшиеся по одну или другую сторону от области, представленной в мРНК (вероятнее всего, слева от 5'-конца мРНК), и, возможно, участвуюшие в регуляции. Также могут существовать и обширные нетранскрибируюшиеся области, необходимые для регуляции транскрипции; таким образом, размер единицы экспрессии гена может значительно превышать размер мРНК. Действительно, оказывается, что многие эукариотические гены гораздо длиннее своих мРНК. Но это связано с наличием в них вставок, разделяющих разные части кодирующего участка ДНК. По крайней мере этим частично объясняется разница в размерах мРНК и ядерной РНК: такие вставочные последовательности (интроны) входят в состав первичного транскрипта, но удаляются из него при созревании с образованием мРНК. Хотя прерываюшие последовательности (интроны) входят в состав структурного гена, они не обладают функцией кодирования, и не ясно, выполняют ли они какую-либо структурную функцию, кроме их удаления при экспрессии генов.
Здесь мы должны вкратце вспомнить терминологию, использованную в гл. 3 при описании взаимоотношений между геном и его РНК-продуктом. Прерывистый ген состоит из различающихся между собой групп экзонов и внтронов. Экзоны — это последовательности, представленные в РНК (мРНК, рРНК или тРНК, т.е. в одних случаях они осуществляют функцию кодирования белка, в других — нет).
Интроны — это прерывающие ген вставочные посдедовательности, которые удаляются из первичного транскрипта и поэтому отсутствуют в зрелой РНК. Ген, конечно, должен начинаться н кончаться экзонами (соответствуюшими 5' и 3'-концам РНК), но внутри него может быть любой набор интронов. Экзоны и интроны'часто обозначают цифрами или буквами в порядке их расположения вдоль гена. Прерывание кодирующих областей характерно только для эукариот, но обнаружено не для всех эукариотических генов. Разумеется, к настоящему времени охарактеризовано еще недостаточное число генов для определения среднего соотношения между размером гена и мРНК.
Поэтому до сих пор не понятно, в какой степени факт наличия интронов помогает объяснить парадокс величины С, но не похоже, чтобы он объяснил этот парадокс полностью. Следующий вопрос после обсуждения структуры собственно гена касается определения его состава. Какое количество материала по обе с~ороны от гена участвует в его функционировании? На каком расстоянии от сосед- него гена он расположен и какую часть генома составляют последонательности, находящиеся между транскрипционными единицами? Связаны ли между собой соседние гены и сушествует ли какой-либо механизм регуляции функционирования областей хромосом, имеюших большую длину, чем отдельные гены? Обнаружение прерывистых генов Существование прерывистых генов было обнаружено в результате экспериментов по вьшелению ДНК гена, соответствующего специфической мРНК.
Когда эта работа начиналась, ее целью было не само по себе сравнение последовательностей двух нуклеиновых кислот, а локализация в геноме последовательности ДНК, соответствующей мРНК. Это в свою очередь позволяет идентифицировать и охарактеризовать фланкируюшие последовательности, включая и возможные регуляторные зоны. Таким образом, основная идея этого подхода заключалась в том, чтобы проследовать от мРНК обратно к гену, определить строение целостной единицы транскрипции, включая промоторы и другие элемснты, не обязательно представленные в мРНК. Выяснение характеристик окружения, в котором находится структурный ген, до сих пор остается целью таких экспериментов, в ряде случаев достигнутой, как мы увидим в гл.
2П Вначале предполагали, что мРНК должна иметь такую же последовательность оснований, как ДНК, с которой она транскрибирована. Для доказательства того, что выделенная из генома последовательность ДНК действительно совпадала с последовательностью мРНК, использованной для ее вселения, их нуклеотидные последовательности сравнивали с помощью как электронной микроскопии, так и рестрикционного картирования.
Но выявлены были как раз различия между их нуклеотидными последовательностями, заключаюшиеся в наличии дополнительных участков, присутствующих в ДНК генома, но отсутствуюших в мРНК. Обнаружение прерывистых генов с помощью электронной микроскопии Электронная микроскопия может быть использована для выявления РНК вЂ” ДНК-гибридов двумя способами. В обоих случаях цель исследования состоит в том, чтобы отличить РНК вЂ” -ДНК-гибриды от участков неспаренной ДНК. Тогда длина и относительное расположение гибридного участка указывают на местонахождение последовательности ДНК, представленной в мРНК. РНК можно гибридизовать с одноцепочечной ДНК.
В этом случае комплементарные области образуют двухцепочечный гибрид, в то время как другие области остаются одноцепочечными. Двухцепочечный участок имеет большую толшину, чем одноцепочечный, хотя иногда трудно точно разграничить расположение двух участков. На рис. 20.1 показано, что метод позволяет обнаружить непрерывную последовательность ДНК, представленную также и в РНК, поскольку соответствуюший участок имеет большую толщину, чем тонкая одиночная цепь ДНК, внутри которой он находится. При использовании метода картираванин К-нетель РНК гибридизуют с двухцепочечной ДНК в условиях, при которых гибрид РНК вЂ”.ДНК более стабилен, чем исходная двухцепочечная ДНК.
Это позволяет заменить одну из цепей ДНК-дуплекса на РНК в той области, где 20. Структурные гены: внутренняя организация 247 Рнс. 20.1. Одноценачечную ДНК гнбриднзуют с РНК с образованием структуры, н которой гибридную область можно обнаружить с помощью электронной микроскопии. Точная длина лнухпепочечнога участка зависит ат условий, на 1 мкм примерно соответствует 3250 н. н. В верхней честя этого н схедуюшнх рисунков нронсхадяшне событнн нллюстрнруютсн с тачки зрении наееденнн отдельных деней ДНК н РНК В нижней части рисунков нрннедены дсйстннтеньно наблюдаемые н энектронный мнкроскон картины, где области большей н меньшей толщины соогнетстнуют двух- н одноненачечным участкам.
РНК может спариться с комплементарным ей участком. На рис. 20.2 показано, что замешенная на РНК цепь ДНК образует петлю, окруженную интактной двухцепочечной ДНК. Образование петли и дает название этому методу. Основная особенность методов, приведенных на рис. 20.1 и 20.2, заключается в том, что, когда РНК соответствует непрерывной последовательности ДНК, обе Рнс. 20.2. В условиях образования й-нетель РНК гнбрнднзуется с ДНК, вытесняя одну нз леней двойной спирали. Рнс, 20.3.
Прн гибридизации РНК с двумя участками аднаценачечвай ДНК, разделенными промежуточной последовательностью, место нахождения ннтрана выглядит как несгябрнднзававшаяся однацепочечная петля ДНК, ныстунаюшан нз шгбрнда. молекулы колинеарны. Тогда внутри молекулы ДНК образуется единая непрерывная область гибрида. Но когда в сос~ав гена входят последовательности, отсутствующие в составе мРНК, эта часть ДНК не может гибридизоваться с РНК. Однако РНК может спариваться с последовательностями, находящимися по обе стороны от прерывающей послеловательностн, с образованием гибридных участков.
Это приводит к возникновению характерных структур, выявляемых каждым из рассматриваемых электронно-микроскопических методов. При гибридизации РНК с одноцепочечной ДНК промежуточная последовательность имеет вцд одноцепочечной петли ДНК, выступающей из области РНК вЂ” ДНК- гибрида. Это показано на рис. 20.3, Длина и расположение петли внутри гибрида определяют размер и локализацию интрона внутри транскрипционной единицы. При использовании метода картировання К-петель РНК замещает одну цепь ДНК, гибридизуясь с участками ДНК по обе стороны от промежуточной последовательности. Но сама промежуточная последователыгость остается неизменной, сохраняя исходное двухцепочечное строение.
В результате образуется структура, приведенная на рис. 20.4, где два участка, кодирующие РНК, в гибриде объединены, как это видно по двум вытесненным из гибрида одноцепочечным петлям ДНК. В месте соединения этих петель наружу вытесняется двухцепочечная петля ДНК, соответствующая промежуточной последовательности. В приведенном на рнс. 20.5 примере виден единственный интрон 13 ша'-глобинового гена мыши. (В этом гене также имеется и второй интрон, размеры которого слишком малы для того, чтобы он был виден в электронный микроскоп; см, ниже.) Первые результаты такого рода были получены для вирусных гепомов: для аденовируса и вируса БТУ-40. В каждом случае прн гибридизации поздних мРНК с вирусной ДНК основная часть мРНК образовывала гибрид с одним участком вирусной ДНК, но 5'-концевая область 248 Часть У.
Строение генома эукариот Гмбриднаацм онк РНК вытасняст ДНК.и две области, кодируюшие ОНК, приблнюпотся друг к пруту Деукцепоте ая црдбоЭЧООООдООЭОУООООЛтЛтОООЦЮМОООООЮМЖооолыЛтЛМ днк ДН К промамутотной последоватсл иост не та меняется на РН К Область брнде с двумя вытесненными олноцепота ымн пепмми м олной ЪЖЯ6эЛ 'ХЛтттзтчтЫЯЛ66 еыступаюшейдвулц по е ой петлей Рис. 20.4. Нри гибридизации РНК с прерывистым геном при кйртирования К-петель промежуточная последовательность гнбрилиэоваться ие может и Остаетоя в виде двухцепочечной ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
