Диссертация (1174340), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Поэтому,несмотря на высокую чувствительность ДНК-скрининга при выявлениианеуплоидий по 13 и половым хромосомам, специфичность диагностикиниже, чем для 21 и 18 хромосом. Возможно, что это объясняетсяплацентарным мозаицизмом, т.к. анеуплоидии по этим хромосомам могутбыть менее критичны для функционирования плаценты.Ложноотрицательный результат, полученный при выявлении трисомии21 подробно описан в разделе “Описание клинических случаев”. Он связан смозаицизмом у плода, характеризующимся наличием трех клонов клеток:моносомного, нормального (дисомного) и трисомного.
При исследованииноворожденного методом FISH для 21 хромосомы было обнаружено 77 (76%)ядер с 3 сигналами, 18 ядер (18%) с 2 сигналами и 6 (6%) ядер с 1 сигналом.Отсроченное исследование 70 вторых (контрольных) аликвот плазмы,проведенноечерезгодпослепервоначальногоисследования,продемонстрировало полное совпадение результатов.3.1.2 Определение происхождения анеуплоидий при ДНК-скринингеМатеринскиеанеуплоидииявляютсячастойпричинойложноположительных результатов ДНК-скрининга.
В настоящей работе имибыли обусловлены 4 из 9 (44%) ложноположительных результатовисследования, в первую очередь с вовлечением хромосомы Х. Послевведения разработанного нами алгоритма анализа, позволяющего различатьматеринскоеиплодовоепроисхождениеанеуплоидийпополовымхромосомам, количество ложноположительных случаев резко сократилось. Вслучае, если анеуплоидными являются все клетки матери, их выявление81обычно не представляет сложности из-за аномально высокого изменения впокрытии хромосомы.
Однако, зачастую моносомии по Х хромосоменаблюдаются в мозаичной форме, в таких случаях изменения в покрытии Ххромосомы могут быть сопоставимыми с анеуплоидиями плодовогопроисхождения. Как уже указывалось выше, распределение длин плодовой иматеринской ДНК отличаются между собой - фрагменты ДНК плодовогопроисхождения обычно короче, чем материнские. Как правило, фрагментысвободноциркулирующей ДНК имеют размер менее 200 п.н.
При этомвозможная длина прочтения для полупроводникового секвенатора достигает400 п.н. Поскольку в процессе приготовления библиотек для секвенированиявнеклеточной ДНК не требуется этап её фрагментации и отбора по длине, тологично предположить, что распределение прочтений по длине отражаетреальные длины анализируемых фрагментов. Распределение значений долиплодовой ДНК для Х хромосомы при анализе фрагментов разной длины висследуемых образцах приведено на рисунке 16.
Видно, что при отборе дляанализа фрагментов ДНК меньшей длины, для анеуплоидии плодовогопроисхождения «эффективная» доля плодовой ДНК возрастает, если жеанеуплоидия в исследуемом образце материнского происхождения, доляплодовой ДНК остается неизменной. Алгоритм дополнительного анализадля случаев высокого риска моносомии по Х хромосоме по даннымНИПС представлен на рисунке 17.
Проведение дополнительного этапаанализа позволяет выявить случаи, когда результаты ДНК-скринингаобусловлены особенностями кариотипа матери и значительно увеличитьположительное предсказательное значение исследования.82Рисунок 16. Распределение значений доли плодовой ДНК для Х хромосомыпри анализе фрагментов разной длины.Рисунок 17.
Алгоритм дополнительного анализа при выявлении по даннымДНК-скрининга высокого риска моносомии по хромосоме Х.833.1.3 Определение доли плодовой ДНКВ ходе валидации было продемонстрировано, что при низкой долеплодовой ДНК в образце возможны ложноотрицательные результаты.Определение доли плодовой ДНК просто осуществить в случае сбеременностью плодом мужского пола, с этой целью применяют сравнениепокрытия Y хромосомы с покрытием остальных аутосом.
Если же плодженскогопола,тооценкапредставленностиплодовыхфрагментовстановится сложной задачей. Для определения доли плодовой ДНК былвыбран подход, основанный на поиске однонуклеотидных полиморфизмов,которые находятся в гомозиготном состоянии у матери и в гетерозиготном уплода. Были отобраны 85 полиморфизмов с частотой встречаемостигетерозиготного генотипа 49-51% для европейской популяции и 45-55% дляафриканской, китайской и японской популяций.
Данные полиморфизмырасполагаются на расстоянии не менее 20 млн. п.н. на 1-12 хромосомах.Специфичные праймеры для амплификации каждого из выбранныхфрагментов были подобраны таким образом, чтобы длина амплификата непревышала 110 п.н. Список полиморфизмов и последовательности праймеровприведены в таблице 1. Часть полиморфизмов исключили из дальнейшегоисследования в ходе предварительных испытаний в связи с отсутствиемпродукта амплификации на гель-электрофорезе, отличием длины фрагментаот ожидаемой, либо если было более одного продукта амплификации.Оценку доли плодовой ДНК проводили с помощью секвенирования 53частотных полиморфизмов. После выравнивания на референсный геном, дляпозиций на геноме, соответствующихподсчитываливыбраннымполиморфизмам,количество прочтений для каждого из аллелей. Для анализаиспользовали только фрагменты с качеством выравнивания не менее 30 и сдлиной не менее 80% от ожидаемой длины фрагмента.Определение доли плодовой ДНК проводили с использованиемполиморфизмов с покрытием не менее 1000 прочтений, для которых84представленность одного аллеля была 80-99,5%.
Сравнение результатовопределения доли плодовой ДНК с применением однонуклеотидныхполиморфизмов и по Y хромосоме проводилось посредством исследования158 образцов крови от беременных плодом мужского пола. Среднееколичество полиморфизмов, для которых у матери был гомозиготныйгенотип, составило при секвенировании 27 (24-29), при этом около половиныиз них были информативными. Сравнение определения доли плодовой ДНКпо Y хромосоме и с помощью SNP представлено на рисунке 18.Рисунок 18. Сравнение определения доли плодовой ДНК по Y хромосоме и спомощью SNP.При сравнении доли плодовой ДНК, установленной с помощью SNP ипо данным, полученным при исследования хромосомы Y установленакорреляция г=0,7. Медиана абсолютной разницы значения доли плодовойДНК, определенной с использованием SNP и Y хромосомы, составила 1,8%(0,8-2,8%), для образцов с долей плодовой ДНК ниже 6% - 1,1% (0,5-1.8%).853.1.4 Зависимость доли плодовой ДНК от массы тела и от ИМТРисунок 19.
Зависимость доли плодовой ДНК от массы тела.На рисунке 19 представлен график зависимости доли плодовой ДНК отмассы тела беременной женщины. Наблюдается снижение доли ДНК плода сростом массы тела, однако коэффициент корреляции равен всего лишь -0,2.Рисунок 20. Зависимость ИМТ от массы тела.На рисунке 20 представлен график зависимости ИМТ от массы тела.Коэффициент корреляции 0,91.86Рисунок 21.
Зависимость доли плодовой ДНК от ИМТ.На рисунке 21 представлен график зависимости доли плодовой ДНК отИМТ беременной женщины, наблюдается снижение доли ДНК плода сростом ИМТ, коэффициент корреляции -0.18. Несмотря на то, что приувеличении массы тела и ИМТ доля ДНК плода снижается, образцы длякоторых доля ДНК плода была ниже необходимого минимума наблюдаласьсреди женщин с различной массой тела. При проведении исследования намине выявлено достоверных отличий между женщинами с разным ИМТ, т.е.высокий ИМТ не является противопоказанием к проведению исследованияпри определении в процессе исследования доли плодовой ДНК.3.1.5 Зависимость доли плодовой ДНК от срока беременностиНа рисунке 22 представлен график зависимости доли плодовой ДНК отсрока беременности.
С ростом срока беременности не наблюдается ростадоли плодовой ДНК, коэффициент корреляции 0, что отличается от данныхпредставленных в литературе. Вероятно, это обусловлено тем, что большаячасть исследований была проведена в сроках 11-15 недель, для более позднихсроков беременности проведено небольшое количество исследований. По87данным Wang и соавторами, на сроках беременности 10 - 21 неделя доляДНК плода растет очень медленно, примерно на 0,1% в неделю [75]. Крометого, с увеличением срока беременности растет ИМТ.Рисунок 22.
Зависимость доли плодовой ДНК от срока беременности.3.1.6 Транспортировка материала для исследованияПроведен анализ возможности ДНК-скрининга образцов, доставленныхиз ФГБУ "ИвНИИ МиД им. В.Н.Городкова" Минздрава России (г.Иваново).Проводился сравнительный анализ образцов, забранных в пробирки с EDTA,прошедших процедуру отделения плазмы по месту забора крови и еёзамораживание(доставказамороженнойплазмыосуществляласьвлабораторию молекулярно-генетических методов ФГБУ “НМИЦ АГП им.В.И.
Кулакова” Минздрава России машиной-рефрижератором) с образцамикрови, забор которых осуществлялся в пробирки Cell-Free DNA BCT (Streck,США) объемом 10 мл, которые не подвергались заморозке.Образцы впробирках Cell-free DNA BCT доставлялись в лабораторию на исследованиев течение 2-х недель с момента забора. При анализе сравниваласьконцентрация выделенной ДНК для разных пробирок и доля плодовой ДНК.88Медиана доли плодовой ДНК для пробирок с EDTA составила 10,4%,для пробирок Cell-free DNA BCT 10,2%. Медианы концентрации выделеннойДНК составили 0,113 нг/мкл и 0,108 нг/мкл соответственно.
Результатысравнения распределения доли плодовой ДНК для образцов, забранных впробирки с EDTA и Cell-free DNA BCT приведены на рисунке 23. Сравнениераспределения концентрации выделенной ДНК для образцов, забранных впробирки с EDTA и Cell-free DNA BCT приведено на рисунке 24. В обоихслучаях достоверных различий не наблюдалось.Рисунок 23.
Сравнение распределения доли плодовой ДНК для образцов,забранных в пробирки с EDTA и Cell-free DNA BCT.Рисунок 24. Сравнение распределения концентрации выделенной ДНК дляобразцов, забранных в пробирки с EDTA и Cell-free DNA BCT.893.1.7 Пренатальная диагностика с применением микроматричногоанализаКак правило, у пациентов с высоким риском хромосомной патологии порезультатам ДНК-скрининга исследование с применением микроматричногоанализаосуществлялосьвкачествеальтернативыстандартномуцитогенетическому кариотипированию на больших сроках беременности(выше 20 недель). Этот метод не требует этапа культивирования ирезультаты могут быть получены значительно быстрее (как правило, за 5-10дней).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
