Диссертация (1174340), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Культивированиепроводили 72 часа при температуре 37С. За 1,5 часа до окончаниякультивирования встряхивали флакон и вводили колхицин в конечнойконцентрации0,5 мкг/мл.Данныйэтапнеобходимдлянакоплениялимфоцитов в стадии метафазы. По окончании культивирования клетки спитательной средой переносили пробирки для центрифугирования иосаждали в течение 10 минут при 1000g. Полученный осадок обрабатывали20 минут гипотоническим раствором 0,075 М хлорида калия при 37C. Послепроведения гипотонии центрифугировали при 1000g в течение 10 минут.Затем клетки фиксировали с помощью охлажденной до 4С смеси этанолуксусная кислота в соотношении 3:1, приготовленной непосредственно передиспользованием. После окончательного центрифугирования при 1000g, 10минут,супернатантудаляли,суспензиюраскапывалинавлажныеохлажденные стекла, после этого высушивали на воздухе.
Цитогенетическоеисследование проводили с применением модифицированной методикидифференциального окрашивания метафазных хромосом (G-окраска), поSeabright [15]. Для этого препараты хромосом при комнатной температуре10-20 секунд обрабатывали 0,25% раствором трипсина, затем триждыпромывали в растворах 700, 960 и абсолютного спирта не менее 30 секунд вкаждом. Препараты высушивали на воздухе, для окрашивания применяли 5%раствор красителя Гимза, приготовленный на фосфатном буфере (pH 6,8).Время окрашивания 5-10 минут, после окраски препараты промывалидистиллированнойводой,затемвысушивалинавоздухе.Образцы64нормальных кариотипов 46,ХХ (женский) и 46,XY (мужской) представленына рисунке 10.Рисунок 10.
Стандартное цитогенетическое исследование с применениемдифференциального G-окрашивания метафазных хромосом.Слева представлен нормальный женский кариотип 46,XX; справанормальный мужской кариотип 46,XY.2.3.2 Проведение молекулярно-цитогенетического исследования (FISH)Выявление анеуплоидий с применением метода FISH проводили сиспользованиемсоответствующихзондовVysisFishProbes(AbbottMolecular, США) на хромосомы 21, 18, 13; для исследования половыххромосомприменялизондыVysisCEPX/Y,согласнопротоколупроизводителя.2.3.3 Проведение молекулярного кариотипированияИсследованиеанеуплоидийсприменениеммолекулярногокариотипирования (микроматричного анализа) проводилось на микрочипахCytoScanOptimaпроизводителя.Array(Affymetrix,США),согласнопротоколу652.3.4 Проведение QF-PCRПроведение QF-PCR осуществляли с применением набора реагентов длядетекции трисомий по 13, 18, 21 и половым хромосомам Aneufast QF-PCR Kit(Genomed Biotech Ltd, Великобритания), в соответствии с прилагаемым креагентам инструкциям производителя.2.3.5 Выделение внеклеточной ДНК и проведение ПЦРВыделение внеклеточной ДНК проводили из 1-2 мл плазмы с помощьюнабора реагентов MagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit (Thermo FisherScientific, США), в соответствии с прилагаемой к реагентам инструкциейпроизводителя.КонтролькачестваполученнойвнеклеточнойДНКпроводили на приборе Bioanalyzer 2100 (Agilent, США) с использованиемнабора High Sensitivity DNA Kit (Agilent, США).
Образцы получаемыхрезультатов представлены на рисунках 11-13.Рисунок 11. Нормальный вид внеклеточной ДНК (Agilent Bioanalyzer 2100).66Рисунок 12. Вид внеклеточной ДНК. Кроме целевого пика в большомколичестве присутствует высокомолекулярная фракция (Agilent Bioanalyzer2100).Рисунок 13. Вид внеклеточной ДНК. Значительно повышен уровеньапоптотической ДНК (Agilent Bioanalyzer 2100).Для определения доли плодовой ДНК осуществлялась амплификацияполиморфных локусов ДНК.
Она проводилась с помощью ПЦР, сприменением специфичных олигонуклеотидов (праймеров). Амплификацияпроизводилась мультиплексно, т.е. все локусы ДНК амплифицировалисьодновременно в одной пробирке. В качестве субстрата для амплификациислужила внеклеточная ДНК, выделенная из плазмы.672.3.6 Приготовление библиотек для секвенированияДля каждого образца готовили две разные библиотеки.
Первуюбиблиотеку для секвенирования внеклеточной ДНК, которую использовалидля определения риска наличия анеуплоидии у плода. Вторую - длятаргетного секвенирования однонуклеотидных полиморфизмов, которыеприменяли для оценки доли внеклеточной ДНК плода в образце, внезависимости от пола плода.1.Приготовлениебиблиотекдлявысокопроизводительногосеквенирования проводили согласно инструкциям производителя, без этапаразрушения (шеринга) первоначальной ДНК, поскольку внеклеточная ДНКизначально сильно фрагментирована, длина её фрагментов составляет 100200 п.н. Измерение концентрации полученной из плазмы ДНК производилина флуорометре Qubit 2.0 с использованием наборов Qubit dsDNA HS AssayKit (Thermo Fisher Scientific, США).
Для приготовления библиотеки ДНКиспользовали 2-10 нг внеклеточной ДНК.Приготовление библиотеквключало этапы:• формирование тупых концов на фрагментах ДНК c использованиемEnd repair enzyme и последующей очисткой образца с помощью магнитныхчастиц AMPure XP beads (Beckman, США);• лигирование адаптеров и баркодов P1-A-BC.
Использовали 16-тикратное разведение всех адаптеров, поскольку количество входящей ДНКниже рекомендуемого производителем. Очистку образца проводили спомощью магнитных частиц AMPure XP beads;• ник-трансляция и амплификация с помощью Platinum® PCR SuperMixHigh Fidelity. Проводили 6 циклов с использованием универсальныхадаптеров и последующей очисткой образца с помощью магнитных частицAMPure XP beads;68• измерение концентрации и оценку качества приготовленных библиотекпроводили с использованием прибора Bioanalyzer 2100 фирмы Agilent(США);• проведение эмульсионной ПЦР, обогащение библиотек и нанесение начип проводили при помощи автоматической станции Ion Chef. За один запускприбора готовили сразу 2 чипа;• секвенирование проводили на приборах Ion Proton или Ion S5. Дляприбора Ion Proton использовали чипы P1 v2 и v3, а для Ion S5 чипы 540.2.
При приготовлении библиотек для таргетного секвенирования проводилиПЦР-амплификациюДНКсиспользованиемспецифичныхолигонуклеотидов (праймеров). Список однонуклеотидных полиморфизмов ипоследовательности олигонуклеотидов приведены в таблице 1. В таблицеприведены предварительно отобранные для таргетного секвенированияолигонуклеотиды на хромосомах 1-12, их позиции в геноме (версия hg38) ипоследовательности олигонуклеотидов, используемые для амплификации.Знаком “+” отмечены олигонуклеотиды, вошедшие в окончательную панель,сучетомчастотыихвстречаемостиипровереннойнапрактикеработоспособности.Измерение концентрации полученного ПЦР-продукта производили нафлуорометре Qubit 2.0, с использованием наборов Qubit dsDNA BR Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, США). Дляприготовлениябиблиотектаргетного секвенирования использовали от 8 до 14 нг амплификата ПЦР.для69Таблица 1.
Однонуклеотидные полиморфизмы.70Таблица 1. Однонуклеотидные полиморфизмы (продолжение).Приготовлениебиблиотекдлявысокопроизводительногосеквенирования проводили согласно инструкциям производителя безэтапа разрушения первоначальной ДНК и формирования тупых концов нафрагментах, поскольку полученные ПЦР продукты имеют длину 70110 п.н.,адляамплификациииспользуютсяфосфорилированныепраймеры. Список необходимого оборудования и реактивов приведен втаблице 2. Приготовление библиотек включало этапы: лигирование адаптеров и баркодов P1-A-BC. Использовали 16-тикратноеразведениевсехадаптеров,посколькуколичество71входящей ДНК ниже рекомендуемого производителем.
Очисткуобразца проводили с помощью магнитных частиц AMPure XP beads;Таблица 2. Наборов реагентов, использованных для проведения ДНКскрининга.ЭтаписследованияВыделение ДНКПриготовлениебиблиотек длясеквенированияПриготовлениебиблиотек длясеквенированияПриготовлениебиблиотек длясеквенированияИзмерениеконцентрацииДНКИзмерениеконцентрацииДНКИзмерениеконцентрацииДНКРеагентПроизводительMagMAXTM Cell-Free DNAIsolation KitThermoFisherIon Xpress Plus Fragment LibraryKitThermoFisherIon Xpress™ Barcode Adapters 196 KitThermoFisherAMPure XP beadsBeckmanQubit dsDNA HS Assay KitThermoFisherQubit dsDNA BR Assay KitThermoFisherHigh Sensitivity DNA KitAgilent TechnologiesСеквенированиеNaOH, 10 M раствор, molecularbiology gradeСеквенированиеDynabeadsMyOneStreptavidin C1ThermoFisherСеквенированиеIon PI™ Template OT2 200 Kit v3ThermoFisherСеквенированиеIon 540™ Kit-OT2ThermoFisherСеквенированиеIon PI™ Sequencing 200 Kit v3ThermoFisherСеквенированиеIon PI™ Chip Kit v2ThermoFisherСеквенированиеIon 540™ Chip KitThermoFisher ник-трансляцияиспользованиемиамплификация.универсальныхSigmaAldrichПроводилиадаптеров.6цикловОчисткусобразца72проводили с помощью магнитных частиц AMPure XP beads; измерениеконцентрациииоценкакачестваприготовленныхбиблиотек, которые проводили с использованием прибора Bioanalyzer2100 фирмы Agilent; проведение эмульсионной ПЦР, обогащение библиотек и нанесениена чип, его проводили при помощи автоматической станции IonChef, за один запуск прибора готовили одновременно 2 чипа; cеквенирование, которое проводили на приборах Ion Proton и Ion S5.Для Ion Proton использовали чипы P1 v2 и v3, для Ion S5 чипы 540.2.3.7 Обработка данныхПервичнуюобработкуданныхсеквенирования-определениепоследовательности ДНК, выравнивание её на референсный геном человекасборки hg19, фильтрацию ПЦР дупликатов проводили с использованиемуправляющего прибором сервера Torrent Server, TMAP, FilterDuplicates v 5.4.После выравнивания прочитанных фрагментов на референсный геном ифильтрации ПЦР-дупликатов проводили:1.
фильтрацию фрагментов по качеству выравнивания;2. фильтрацию не уникальных участков генома;3. GC-коррекцию с использованием локальной линейной регрессии свесовыми коэффициентами;4. подсчет параметров Z-score и T-score;5. контроль параметров качества проведения анализа.Анализданныхпроводилисиспользованиемсобственногопрограммного обеспечения, разработанного лаборатории молекулярногенетических методов ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” МинздраваРоссии. Схема процесса анализа риска наличия анеуплоидий приведена нарисунке 14.73Рисунок 14. Схема процесса анализа риска наличия анеуплоидий у плода.В случае выявления высокого риска моносомии по хромосоме Х,проводили дополнительный анализ, с целью уточнения риска наличиямозаичной формы моносомии по хромосоме Х у самой матери.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
