Диссертация (1174340), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Предварительныерезультаты использования НИПС при многоплодной беременности оказалисьобнадеживающими, однако, из-за недостаточного количества исследований,проблемы “исчезающего близнеца”, профессиональные общества призвали кувеличению усилий в этом направлении [127,150,151, 152,153,154].56Глава 2. Материалы и методы исследования2.1 МатериалыДля анализа внеклеточной ДНК крови матери в работе исследовались1918 образцов плазмы крови беременных женщин. Помимо этого, в работеанализировалисьзамороженнаяпериферическаяплазмаамниотическаякрови,жидкость,жидкаяматериалбиоптатыкровьноворожденных,биопсииплаценты.ворсинВсехориона,исследованиявыполнялось добровольно, по желанию женщины, после подписаниясоответствующихформинформированногосогласия.Образецинформированного согласия представлен в приложении 2.
С цельювалидации метода, а также определения возможности транспортировкиобразцов ретроспективно проведено исследование двух групп беременныхженщинсприменениемвысокопроизводительногосеквенированиявнеклеточной ДНК.Первую ретроспективную группу составили 286 образцов плазмы кровибеременных женщин, которые наблюдались в ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И.Кулакова” Минздрава России. Образцы первой ретроспективной группыбыли получены у женщин, направленных на пренатальную инвазивнуюдиагностику с целью проведения кариотипирования плода. Получениематериала для неинвазивного ДНК-скрининга осуществлялось в пробирки сантикоагулянтом этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) объемом 910 мл на сроке беременности 10-20 недель, медиана составила 14 недель.Обследование также включало: скрининг I–II триместра беременности (УЗИ,определение содержания сывороточных маркеров, компьютерный анализ);цитогенетическое исследование; инвазивные процедуры.
Внутриматочныевмешательства с целью получения хориона, плаценты, амниотическойжидкости выполняли в 11-14 недель или в 17-20 недель в связи спротивопоказаниями к проведению в ранние сроки беременности или57позднимобращениемженщины.Увсехженщинбылополученоинформированное согласие на инвазивную пренатальную диагностику(биопсия ворсин хориона, плаценты, амниоцентез). Во всех 286 наблюденияхпациентов первой ретроспективной группы в образцах тканей плодовогопроисхождения (хорион, плацента, амниотическая жидкость) был определенкариотип плода с помощью стандартного цитогенетического метода, апериферическая кровь женщин была исследована на наличие анеуплоидий иY-хромосомы у плода с помощью ДНК-скрининга анеуплоидий по кровиматери.
Все беременные имели высокий риск хромосомной патологии плода,обусловленный возрастом, изменениями в уровнях сывороточных маркеров,особенностями фенотипа плода. Подсчет рисков осуществлялся с помощьюкомпьютерных программ Astraia и Prisca. Схема обследования пациентовпервой ретроспективной группы представлена на рисунке 8.Вторая ретроспективная группа состояла из 477 образцов беременныхженщин в сроке от 8 до 20 недель гестации, которые обследовались условияхмедико-генетической консультации ФГБУ "ИвНИИ МиД им. В.Н.Городкова"Минздрава России (г.Иваново).
63 из 477 образцов использовались привалидации выявления анеуплоидий с помощью ДНК-скрининга, в этойподгруппе 22 образца имели установленную цитогенетически хромосомнуюпатологию. Все 477 образцов второй ретроспективной группы исследовалисьдля определения сохранности внеклеточной ДНК при транспортировке вФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава России. Забор кровиосуществлялся как в пробирки с ЭДТА объемом 9-10 мл, с получениемплазмы и её заморозкой по месту взятия материала, так и в пробирки CellFree DNA BCT (Streck, США) объемом 10 мл, которые не подвергалисьзаморозке и доставлялись на исследование не позднее 14 дней после заборакрови.Пробиркихранилисьитранспортировалисьмашиной-рефрижератором в соответствии с рекомендациями производителя притемпературе не ниже +6С.58Рисунок 8.
Схема обследования пациентов первой ретроспективнойгруппы.В рамках проспективного исследования было проанализировано 1155образцовженщин,которыепроходилимедико-генетическоеконсультирование в ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” МинздраваРоссии. В это число входили женщины в т.ч. и с высоким риском ХА (рисквыше 1:100 по данным комбинированного скрининга), которые отказались от59предложенной инвазивной диагностики. Всем женщинам были разъясненыограничения ДНК-скрининга.
Забор крови производился в количестве 9 мл впробирки с ЭДТА, на сроке 11-17 (медиана 14) недель беременности. Всепациентыподписалиинформированноесогласиенапроведениемолекулярно-генетического исследования. При высоком риске анеуплоидийподаннымДНК-скринингапациентамрекомендовалосьпроведениеинвазивной пренатальной диагностики.2.2 Характеристики пациентов и получение материала2.2.1 Ретроспективные группыВ первую ретроспективную группу вошли пациенты с известнымкариотипом, установленным в результате проведения инвазивной процедурыс последующей пренатальной диагностикой.
Большая часть женщин 284(99%) была обследована в связи с высоким риском наличия у плода ХА. В 1случае причиной обследования было пренатальное определение отцовства. В1 случае женщина обследовалась с целью проведения пренатальнойдиагностики гемофилии А, в связи с носительством данного заболевания.Количество образцов с анеуплоидиями в первой ретроспективной группесоставляло 80 (28% процентов).Вовторуюретроспективнуюгруппувошли477пациентов,наблюдающихся в ФГБУ "ИвНИИ МиД им. В.Н.Городкова" МинздраваРоссии, 22 из которых (34,9%) были с установленной хромосомнойпатологией. Указанные 22 пациента с хромосомной патологией и 41 пациентбез патологии составили подгруппу из 63 пациентов, которым произведенДНК-скрининг с целью валидации метода.2.2.2 Проспективная группаПроспективную группу составили 1145 пациентов, наблюдающихся вФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава России. У 104 (9%)60пациентов был определен высокий риск наличия ХА по даннымкомбинированного скрининга (риск выше 1:100).
У остальных 1041 (91%)женщин риск наличия анеуплоидий по данным комбинированного скринингабыл низкий (менее 1/100). Для всех женщин был известен исходбеременности, в случае высокого риска анеуплоидии по данным ДНКскрининга проводилось кариотипирование плода или ребенка, при низкомриске ХА оценка хромосомного статуса новорожденного проводиласьфенотипически.ПриуровневнеклеточнойДНКнижепорогачувствительности метода на более позднем сроке беременности проводилсяповторныйзаборматериала.Всепациентыбылиознакомленысинформацией о проведении ДНК-скрининга, с образцами документов можноознакомиться в приложениях 1-5.2.2.3 Забор крови и отделение плазмыЗабор периферической жидкой крови для проведения ДНК-скринингаосуществлялся в ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава Россиии в ФГБУ "ИвНИИ МиД им.
В.Н.Городкова" Минздрава России впредварительнопромаркированныепробиркиобъемом9-10 мл.Дляполучения необходимого биоматериала объема допускалось использование2-х пробирок меньшего объема (объемом 5 мл), в этом случае каждаяпробирка маркировалась индивидуально. Пробирки заполнялись кровьюполностью, в пределах ±10% от предусмотренного объема.В качестве антикоагулянта для проведения молекулярно-генетическихисследований применялась этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) вконцентрации 1,2-2 мг/мл крови (4-7 ммоль/л). Сразу после получения кровиеё перемешивали с антикоагулянтом, несколько раз плавно переворачиваяпробирку, не допуская встряхивание.Забор крови для ХМА и QF-PCR проводили в аналогичные пробирки сЭДТА объемом 2,5 мл, в которые аспирировали по 2 мл крови. Для61проведениястандартногоцитогенетическихкариотипированияметодовисследованиявсприменениемкачествеантикоагулянтаприменяли гепарин в концентрации 100 eд/мл, забор крови осуществлялся вобъеме 1-2 мл.Помимо обычных пробирок с ЭДТА, забор крови в ФГБУ "ИвНИИМиД им.
В.Н.Городкова" Минздрава России также осуществлялся впробирки Cell-Free DNA BCT (Streck, США) объемом 10 мл.Пробиркихранились и транспортировались в соответствии с рекомендациямипроизводителя при температуре не ниже +6С.Получение двух аликвот плазмы из цельной крови для проведения ДНКскринингапроводилиспомощьюдвухпоследовательныхцентрифугирований. Первое центрифугирование производилось 20 минутпри низком центробежном ускорении (1600g), второе центрифугированиепроизводилось 15 минут при высоком центробежном ускорении (не менее12000g). Это обеспечивает максимальное снижение риска лизиса клеток приполучении плазмы на первом этапе, а также избавление от клеточныхэлементов на втором, что крайне важно, т.к.
контаминация материнскойгеномной ДНК может существенно влиять на долю плодовой ДНК и, какследствие, на результаты ДНК-скрининга. Большая продолжительностьцентрифугирования устанавливалась в случае мутной, хилезной плазмы. Обараза плазму, не задевая осажденную клеточную фракцию, переносили впромаркированные чистые пробирки. В случае, если выделение ДНКпроисходило не сразу после центрифугирования, обе аликвоты плазмы(рабочую и контрольную) до выделения ДНК помещали на хранение притемпературе -20С. В случае, если выделение производилось непосредственнопосле центрифугирования, на хранение помещалась одна аликвота плазмы,которая использовалась в дальнейшем для отсроченного исследования.622.2.4 Проведение амниоцентеза, биопсии ворсин хориона, кордоцентезаПроведение инвазивной пренатальной диагностики осуществлялось вотделении клинической генетики ФГБУ “НМИЦ АГП им.
В.И. Кулакова”Минздрава России. Заборматериала осуществлялся с применениемультразвукового контроля в количестве 5-10 мкг хориона, 10-15 мламниотической жидкости, 1-2 мл крови плода из пуповины.2.2.5 Получение образцов плацентыИсследование материала плаценты проводили с целью верификациислучаевплацентарногомозаицизмапринесоответствиирезультатовинвазивной диагностики, а также кариотипа плода/ребенка с данными,полученными при проведении ДНК-скрининга. Материал плаценты длядальнейшегоисследованиямолекулярно-цитогенетическимиполучали4-хчастей,изразныхвсоответствиисометодамистандартнымпротоколом [93].
Исследование производилось как непосредственно послеполучения материала, так и отсрочено, для этого материал частичнопомещался в парафиновые блоки и хранился при комнатной температуре,частично – помещался на хранение при температуре -20С. Пробоподготовкапри работе с плацентой производилась в патологоанатомическом отделенииФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава России. Схема забораматериала плаценты представлена на рисунке 9.Рисунок 9.
Получение образца плаценты для исследования мозаицизма [93].632.3 Специальные методы исследования2.3.1 Проведение стандартного цитогенетического исследованияКровь в объеме 0,8 мл культивировали в одноразовых флаконах, с 6 млпитательной средой RPMI 1640, содержащей ФГА в концентрации 1 мкг/мл,1,5 мл цельной сыворотки крупного рогатого скота.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
