Диссертация (1174340), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Согласно приказу № 457 от 2000 г в срок 16-20недель беременности должен осуществляться забор проб крови у всехбеременных женщин для проведения исследования у них уровней не менеедвух сывороточных маркеров: альфафетопротеина (АФП) и хорионическогогонадотропина человеческого (ХГЧ), в то же время, согласно приказу № 572н28от 2012 г данное исследование не проводится, а при сроке беременности11-14 недель проводится комплексная пренатальная (дородовая) диагностиканарушений развития ребенка, включающая УЗИ врачами-специалистами иопределениематеринскихсывороточныхмаркеров(связанногосбеременностью плазменного протеина А и свободной бета-субъединицыхорионического гонадотропина) с последующим программным комплекснымрасчетом индивидуального риска рождения ребенка с хромосомнойпатологией.3.
Отличаются показания для направления беременной женщины наконсультацию с целью решения вопроса о проведения инвазивнойпренатальной диагностики. Согласно приказу № 457 от 2000 г показаниямидля ее проведения являются: возраст матери 35 лет и старше; рождение всемьеребенкасхромосомнойпатологией;носительствосемейнойхромосомной аномалии; наличие у плода ВПР; наличие эхографическихпризнаков хромосомной патологии; отклонение уровней сывороточныхматеринских маркеров АФП, ХГЧ и других.
Согласно приказу № 572н от2012 г. показаниями для проведения инвазивной пренатальной диагностикеявляются установлении у беременной женщины высокого риска похромосомным нарушениям у плода (индивидуальный риск 1/100 и выше) в Iтриместре беременности и (или) выявлении врожденных аномалий (пороковразвития) у плода в I, II и III триместрах беременности.4. Оба приказа при пренатально диагностированных врожденныханомалиях (пороках развития) у плода предусматривают проведениеконсилиума врачей, однако состав консилиума в разных приказахотличается: согласно приказу № 457 от 2000 г.
при выявлении ВПР,хромосомной или другой наследственной болезни у плода тактика ведениябеременности определяется консультативно, о чем делается запись вмедицинской документации беременной женщины. Консилиум долженвключать врача-генетика, врача ультразвуковой диагностики, врача акушерагинеколога, по показаниям-врача-неонатолога и других специалистов, а29согласно приказу № 572н от 2012 г в случае установления в медикогенетической консультации (центре) пренатального диагноза врожденныханомалий (пороков развития) у плода определение дальнейшей тактикиведения беременности осуществляется перинатальным консилиумом врачей.в который должны входить врач-акушер-гинеколог, врач-неонатолог и врачдетский хирург.Помимо указанных противоречий, ситуация усугубляется тем, чтоприказ № 572н от 2012 г. определяет порог высокого риска по хромосомнымнарушениямуплода(и,соответственно,критерийобязательногонаправления пациенток на инвазивную диагностику) как 1/100 и выше, азарегистрированная МЗ РФ и разрешенная к применению программа PRISCAпо умолчанию использует порог 1/250.1.6 Неинвазивное выявление анеуплоидий по клеткам плодаВ 70-90-е годы появились противоречивые сообщения о возможностинеинвазивнойгенетическойдиагностикипоклеткамплода,предположительно поступающим в материнский кровоток, а также вразличные отделы цервикального канала.
Одни исследователи сообщали овозможности подобной диагностики [30,31,32,33,36,42]. В то же времядругие не могли воспроизвести их результаты [34,37,43,44,45]. Однако,несмотря на невоспроизводимость получаемых результатов, абсолютнаябезопасность неинвазивного подхода для матери и плода позволяларассматривать его в качестве перспективного [29]. В связи с крайне низкимколичеством циркулирующих в материнском кровотоке клеток плодовогопроисхождения, исследователями предлагались различные способы ихпредварительного обогащения.
Наиболее перспективными представлялисьсортировка с помощью магнитного поля - магнитно-активированнаяклеточная сортировка (MACS) и флуоресцентно-активированная клеточнаясортировка(FACS)сприменениеммоноклональныхантителк30экспрессируемым на клеточной поверхности рецепторам [38,39,40]. Дляположительной флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (т.е.обогащения исследуемого образца клетками плода) применялись, например,положительнаяселекцияспомощьюмоноклональныхантителкгликофорину A (GPA), трансферрину (CD71) с применением ДНКспецифичного красителя Hoechst 33342, который может проникать в живыеклетки.
Для обогащения клетками плода применялась и отрицательнаямагнито-активированная клеточная сортировка, которая производилась,например, с помощью панлейкоцитарных моноклональных антител антиCD45. Обогащение плодными клетками также производили и другимиметодами, в т.ч., с помощью двухэтапного градиентного осаждения клетокпри центрифугировании в растворе фиколл-верографина. Для обогащениякультурылимфоцитовпериферическойкровибеременныхженщинлимфоцитами плода применялись специальные методы культивирования,например,“воздушное”technique) [41].Приэтомкультивированиедлядетекции("air-culture"плодныхcytogeneticклетокобычноиспользовался метод FISH с хромосомо-специфичными ДНК-зондами, чащевсего на 13, 18, 21, Х и Y хромосомы. Применение этих методов позволилодоказать наличие клеток плода в материнском кровотоке и определить ихколичество (1 ядерная клетка плода на 105-108 ядерных материнских клеток),а также продемонстрировать потенциальную возможность примененияметодоввклиническойпрактикедляпроведениянеинвазивногопренатального скрининга анеуплоидий.
При этом наиболее значимыерезультатыбылиполученыприиспользованиифлуоресцентно-активированной клеточной сортировки на проточном цитофлюориметре.Несмотря на потенциальные возможности, широкое применениеметодов выявления анеуплоидий по ядросодержащим клеткам плода в кровиматери в клинической практике не произошло.
В основном это было связанос крайне низким содержанием плодных клеток в исследуемых образцах, атакже с нахождением выявляемых клеток на разных стадиях апоптоза, что31делает их непригодными для исследования. Исследователи указывали также,что часть клеток плода может циркулировать в материнском кровотоке ипосле беременности и это может влиять на результаты, получаемые приповторной беременности [35].В настоящее время отдельные попытки использовать для неинвазивнойпренатальной диагностики ядросодержащие клетки плода не прекращаются.Современныеавторыпредлагаютиспользованиеядросодержащихэритроцитов плода [46], клеток трофобласта [47], а также одновременноеиспользование и ядросодержащих эритроцитов, и клеток трофобласта [48].Описываемаяэффективностьсовременныхметодовобогащениясприменением моноклональных антител позволяет выделить из 4 мл кровиматери 14-22 ядросодержащих эритроцита и 1-44 клетки трофобласта, общаяэффективность составляет 2,38 - 7,25 клеток из 1 мл крови матери.
Дляисследования полученного материала авторами предлагается применениеполногеномной амплификации, которая позволяет из единичных клетокплода получить 50 мкл ДНК в концетрации 290-844 нг/мкл. ПолученнуюДНК авторы предлагают анализировать с помощью STR, с применениеммолекулярногогибридизациикариотипирования(aCGH),либосметодомпомощьюсравнительнойгеномнойвысокопроизводительногосеквенирования [48].1.7 Выявление анеуплоидий по внеклеточной ДНК в крови матери1.7.1 История открытия внеклеточной ДНКВ 1995 году группа российских авторов (Казаков В.И. с соавт.) обратилавнимание на внеклеточную ДНК, циркулирующую в крови беременныхженщин, однако их публикация осталась незамеченной [49].
В 1997 годугруппой авторов под руководством Dennis Lo было предложено исследоватьне клетки плода, а циркулирующую в кровотоке матери свободную,32внеклеточную ДНК плода для проведения неинвазивной пренатальнойдиагностики [50]. При этом относительная концентрация внеклеточной ДНКплода по отношению к внеклеточной ДНК матери в плазме материнскойкрови оказалась существенно выше, чем относительная концентрациягеномной ДНК плода в клеточной фракции [51].
В среднем концентрациявнеклеточной ДНК плода составляет 10-12% от общей ДНК в плазме кровиматери. Было установлено, что свободная ДНК представляет собой короткиедвухцепочечные сильно фрагментировые участки ДНК, их длина составляетменее 200 п.н. [52].Немаловажным оказалось и то, что фрагментыфетальной ДНК равномерно представляют геном плода, а выводятся изорганизма матери непосредственно после родов [53].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
