Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1174340), страница 4

Файл №1174340 Диссертация (Совершенствование системы пренатального скрининга анеуплоидий плода на основе анализа внеклеточной ДНК крови матери) 4 страницаДиссертация (1174340) страница 42020-05-24СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

В частности, онпозволяет выявлять трисомии по 21, 18, 13 и половым хромосомам. Помимоэтого,методпозволяетвыявлятьчастичныеанеуплоидии,обычновозникающие у плода при наличии у клинически здоровых родителейсбалансированных перестроек (транслокаций), в которые вовлечены 21, 18,13 и другие хромосомы, а также обнаруживать крупные делеции идупликации.1.2.2 Исследование полового хроматинаПомимо анализа метафазных хромосом, определение половых хромосомвозможно путем исследования X- или Y-хроматина в интерфазных клетках.Достоверность установления числа X-хромосом при исследовании Xхроматина (телец Барра) составляет около 90% (у плодов женского полательца Барра обычно обнаруживаются в 12-25% амниотических клеток) [16].Несколько выше (около 96%) выявляемость F-телец (Y-хроматина), наличиекоторых связано с флюоресценцией длинного плеча Y хромосомы,проявляющейся при окрашивании флюоресцентными красителями (вчастности, акрихин-ипритом) в виде яркого пятна диаметром 0,3-1,0 мкм[23].Следует отметить, что исследование в интерфазных ядрах телец Барраили выявление окрашенных флюоресцентными красителями Y хромосом винтерфазных клетках, в связи со значительной условностью в трактованиирезультатов анализа, не имеет той достоверности, которая достигается прианализеметафазныхпрепаратов,особенносприменениемметодовдифференциального окрашивания хромосом.

Однако, исследование телецБарра и F-телец продолжает оставаться актуальным, т.к. результаты могутбыть получены за короткое время, а само исследование полового хроматиназначительно менее трудоемкое по сравнению с плохо автоматизируемой17процедурой приготовления препаратов с метафазными пластинками длядифференциального окрашивания хромосом, которая мало изменилась смомента первоначальной разработки в 60-70 годах прошлого века.1.2.3 Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH)В конце 80-х - начале 90-х годов стали интенсивно разрабатыватьсяновые методы, позволяющие проводить исследования по значительноменьшему количеству используемого для анализа материала и обеспечитьвысокую точность без метафазного анализа хромосом. К ним, в первуюочередь, относятся методы анализа ISH (in situ hybridization), в частности,FISH (fluorescence in situ hybridization) и применение полимеразной цепнойреакции (ПЦР).Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) является методом быстрогопроведения цитогенетической диагностики, основанным на специфичнойгибридизации флюоресцентно-меченных зондов с определенными участкамихромосом (обычно это расположенные в районе центромеры хромосомоспецифические альфоидные повторы) [27].

При применении этого методаобычный препарат с интерфазными или метафазными клетками подвергаетсятепловой денатурации в присутствии зонда, например, к Y хромосоме,меченного, как правило, биотином. Дальнейшая обработка препаратафлюоресцентно-меченным гликопротеином из яичного желтка авидином,обладающимспособностьюпрактическинеобратимосвязыватьсясбиотином, позволяет визуализировать исследуемый участок хромосомы.По флюоресценции зондов можно быстро выявить число копийхромосомы и большие структурные перестройки хромосом в интерфазныхядрах. Метод интерфазной гибридизации in situ, несмотря на то, что известенуже давно, продолжает оставаться актуальным для клиники, когда требуетсяполучить результаты быстро, когда клетки плохо культивируются in vitro иликогда отвечающая фракция клеток проявляет плохую способность к18стимулируемой пролиферации, необходимой для метафазного анализа; методпозволяет также избежать ошибок в определении пола при наличиимаркерной Y хромосомы.

При использовании нескольких разных красителей,таких, как флюоресцин (желто-зеленый), родамин (красный) и других можноодновременно визуализировать несколько разных хромосом в одной клетке,чтопозволяетпроизводитьодновременнодетекциюразныханеуплоидий [28].1.3 Молекулярно-генетические методы исследования1.3.1 Полимеразная цепная реакция и QF-PCRДругой хорошо разработанный за последние десятилетия метод полимеразная цепная реакция (ПЦР). Данный метод позволяет быстро испецифично проводить анализ крайне малых количеств ДНК. Прииспользовании ПЦР можно с помощью фермента Taq-полимеразы увеличить(амплифицировать) количество ДНК, содержащееся в одной или несколькихклетках, до количества, достаточного для пренатальной диагностики.Применив соответствующие праймеры (синтезированные искусственноучастки ДНК, ограничивающие амплифицируемый регион) на полиморфныеучастки ДНК (STR - short tandem repeats, короткие тандемные повторы), этимметодом можно быстро установить как наличие исследуемых хромосом, таки их количество.

В практике такой метод выявления анеуплоидий сиспользованием STR-маркеров получил название QF-PCR (QuantitativeFluorescence Polymerase Chain Reaction) или КФ-ПЦР [26]. Теоретически,применение ПЦР позволяет выявить количество ДНК, содержащееся всего водной клетке, находящейся в бесклеточной среде. В образце с другимиклетками при использовании одной пары праймеров генетический материалмужской Y-хромосомы можно выявить среди десятков, если не сотен тысячженских клеток. Обычно такие результаты достигаются с применением19специальных модификаций метода ПЦР, предназначенных повышениячувствительностипроводимойдиагностики.Например,разработанымодификации метода ПЦР с применением “горячего старта” и “нестед”праймеров(в этом случае уже амплифицированная ДНК подвергаетсядополнительной амплификации с использованием другой пары праймеров,комплементарнойпоследовательности,ограниченнойснаружипаройпервоначально примененных праймеров) [25].

Несмотря на это, исследованиес помощью QF-PCR смешенных образцов(более 10-20% примесипосторонней ДНК, например ДНК матери) нежелательно, что связано соспецификой диагностики с применением STR-маркеров. В случае выявленияанеуплоидий в смешенных образцах, в т.ч. при подозрении на мозаицизм,более целесообразно применять цитогенетический метод FISH.1.3.2 Хромосомный микроматричный анализВ последнее время для пренатального выявления анеплоидий все ширеприменяется метод молекулярного кариотипирования на микроматрицах.Хромосомный микроматричный анализ (ХМА) - современная альтернативатрадиционному кариотипированию [24]. Данный метод позволяет избежатьэтапа культивирования при диагностике по амниотической жидкости, приэтом с помощью данного метода можно не только выявлять анеуплоидии(трисомии,моносомии),нодиагностироватьсубмикроскопическиемикроделеции и микродупликации, которые не выявляются при обычномкариотипировании.

Для проведения хромосомного микроматричного анализаиспользуется твердый носитель небольшого размера (микроматрица) изстекла или кремния. В определенном порядке к нему прикреплены короткиеолигонуклеотиды (8-80 п.н.) или фрагменты ДНК (более 100 п.н.).Например, матрицы, используемые для хромосомного микроматричногоанализа американской компанией Affymetrix содержат до 2,7 млн.специфическихолигонуклеотидов(SNP-зонды).ПриобычномХМА20применяетсямикроматрицасреднейплотности(750тыс.зондов),микроматричный анализ высокого разрешения проводится с помощьюмикроматрицы высокой плотности (2,67 млн. зондов). Благодаря этому,удаетсяполучатьинформациюоналичии/отсутствиигенетическогоматериала со значительной части генома.

К недостаткам метода можноотнести невозможность выявлять сбалансированные транслокации, поэтомустандартныйцитогенетическийанализдифференциальноокрашенныххромосом не теряет своей актуальности.1.4 Инвазивные методы получения материала плода1.4.1 АмниоцентезВ настоящее время пренатальная диагностика ХА осуществляется спомощью различных инвазивных методов исследования тканей плодовогопроисхождения: хориона, амниотической жидкости, крови плода и др. Еепоявлению в конце 1960-х годов способствовало описанное выше развитиегенетики соматических клеток, позволившее создать метод изучениякариотипа плода, основанный на исследовании амниотической жидкости,получаемой посредством пункции околоплодного пузыря (амниоцентеза).Впервые амниоцентез был применен с целью лечения многоводия во второйполовине XIX века.

В 1956г. американский акушер F. Fuchs и датскийгастроэнтеролог P. Riis сообщили об успешном пренатальном определенииполового хроматина в клетках, полученных путем амниоцентеза [18]. В 1966М.W. Steel и W.R. Bregсмоглиустановить по культуре клетокамниотической жидкости кариотип плода [19]. В настоящее время обычноамниоцентез осуществляют с 16 недель беременности под контролем УЗИ.Количество извлекаемой амниотической жидкости (1-40 мл) зависит от срокабеременности и задач лабораторной диагностики.Частотапроцедуросвязанныхсоставляет 0,5-2% [20].осложненийпослеамниоцентеза211.4.2 КордоцентезДля пренатального определения кариотипа может быть использована икровь плода, которую получают с помощью пункции сосудов пуповины(кордоцентеза) [21]. Наиболее ранним гестационным возрастом плода, прикотором извлечение его крови в количестве 1 мл не ведет к осложнениям,является 16 недель беременности.

Поскольку в большинстве случаевтребуется большее количество крови, манипуляцию проводят в болеепоздние сроки, вплоть до 27 недель беременности. Как правило, количествоаспирированной крови колеблется от 1 до 5 мл. Частота процедуросвязанныхосложнений после кордоцентеза не превышает 2% [20].1.4.3 Биопсия хорионаС конца 1970-х годов начал широко применяться еще один способполучения ткани в I триместре беременности - биопсия ворсин хориона,впервые примененный отечественными исследователями В.А.

Характеристики

Список файлов диссертации

Совершенствование системы пренатального скрининга анеуплоидий плода на основе анализа внеклеточной ДНК крови матери
Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6384
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее