Диссертация (1174340), страница 4
Текст из файла (страница 4)
В частности, онпозволяет выявлять трисомии по 21, 18, 13 и половым хромосомам. Помимоэтого,методпозволяетвыявлятьчастичныеанеуплоидии,обычновозникающие у плода при наличии у клинически здоровых родителейсбалансированных перестроек (транслокаций), в которые вовлечены 21, 18,13 и другие хромосомы, а также обнаруживать крупные делеции идупликации.1.2.2 Исследование полового хроматинаПомимо анализа метафазных хромосом, определение половых хромосомвозможно путем исследования X- или Y-хроматина в интерфазных клетках.Достоверность установления числа X-хромосом при исследовании Xхроматина (телец Барра) составляет около 90% (у плодов женского полательца Барра обычно обнаруживаются в 12-25% амниотических клеток) [16].Несколько выше (около 96%) выявляемость F-телец (Y-хроматина), наличиекоторых связано с флюоресценцией длинного плеча Y хромосомы,проявляющейся при окрашивании флюоресцентными красителями (вчастности, акрихин-ипритом) в виде яркого пятна диаметром 0,3-1,0 мкм[23].Следует отметить, что исследование в интерфазных ядрах телец Барраили выявление окрашенных флюоресцентными красителями Y хромосом винтерфазных клетках, в связи со значительной условностью в трактованиирезультатов анализа, не имеет той достоверности, которая достигается прианализеметафазныхпрепаратов,особенносприменениемметодовдифференциального окрашивания хромосом.
Однако, исследование телецБарра и F-телец продолжает оставаться актуальным, т.к. результаты могутбыть получены за короткое время, а само исследование полового хроматиназначительно менее трудоемкое по сравнению с плохо автоматизируемой17процедурой приготовления препаратов с метафазными пластинками длядифференциального окрашивания хромосом, которая мало изменилась смомента первоначальной разработки в 60-70 годах прошлого века.1.2.3 Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH)В конце 80-х - начале 90-х годов стали интенсивно разрабатыватьсяновые методы, позволяющие проводить исследования по значительноменьшему количеству используемого для анализа материала и обеспечитьвысокую точность без метафазного анализа хромосом. К ним, в первуюочередь, относятся методы анализа ISH (in situ hybridization), в частности,FISH (fluorescence in situ hybridization) и применение полимеразной цепнойреакции (ПЦР).Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) является методом быстрогопроведения цитогенетической диагностики, основанным на специфичнойгибридизации флюоресцентно-меченных зондов с определенными участкамихромосом (обычно это расположенные в районе центромеры хромосомоспецифические альфоидные повторы) [27].
При применении этого методаобычный препарат с интерфазными или метафазными клетками подвергаетсятепловой денатурации в присутствии зонда, например, к Y хромосоме,меченного, как правило, биотином. Дальнейшая обработка препаратафлюоресцентно-меченным гликопротеином из яичного желтка авидином,обладающимспособностьюпрактическинеобратимосвязыватьсясбиотином, позволяет визуализировать исследуемый участок хромосомы.По флюоресценции зондов можно быстро выявить число копийхромосомы и большие структурные перестройки хромосом в интерфазныхядрах. Метод интерфазной гибридизации in situ, несмотря на то, что известенуже давно, продолжает оставаться актуальным для клиники, когда требуетсяполучить результаты быстро, когда клетки плохо культивируются in vitro иликогда отвечающая фракция клеток проявляет плохую способность к18стимулируемой пролиферации, необходимой для метафазного анализа; методпозволяет также избежать ошибок в определении пола при наличиимаркерной Y хромосомы.
При использовании нескольких разных красителей,таких, как флюоресцин (желто-зеленый), родамин (красный) и других можноодновременно визуализировать несколько разных хромосом в одной клетке,чтопозволяетпроизводитьодновременнодетекциюразныханеуплоидий [28].1.3 Молекулярно-генетические методы исследования1.3.1 Полимеразная цепная реакция и QF-PCRДругой хорошо разработанный за последние десятилетия метод полимеразная цепная реакция (ПЦР). Данный метод позволяет быстро испецифично проводить анализ крайне малых количеств ДНК. Прииспользовании ПЦР можно с помощью фермента Taq-полимеразы увеличить(амплифицировать) количество ДНК, содержащееся в одной или несколькихклетках, до количества, достаточного для пренатальной диагностики.Применив соответствующие праймеры (синтезированные искусственноучастки ДНК, ограничивающие амплифицируемый регион) на полиморфныеучастки ДНК (STR - short tandem repeats, короткие тандемные повторы), этимметодом можно быстро установить как наличие исследуемых хромосом, таки их количество.
В практике такой метод выявления анеуплоидий сиспользованием STR-маркеров получил название QF-PCR (QuantitativeFluorescence Polymerase Chain Reaction) или КФ-ПЦР [26]. Теоретически,применение ПЦР позволяет выявить количество ДНК, содержащееся всего водной клетке, находящейся в бесклеточной среде. В образце с другимиклетками при использовании одной пары праймеров генетический материалмужской Y-хромосомы можно выявить среди десятков, если не сотен тысячженских клеток. Обычно такие результаты достигаются с применением19специальных модификаций метода ПЦР, предназначенных повышениячувствительностипроводимойдиагностики.Например,разработанымодификации метода ПЦР с применением “горячего старта” и “нестед”праймеров(в этом случае уже амплифицированная ДНК подвергаетсядополнительной амплификации с использованием другой пары праймеров,комплементарнойпоследовательности,ограниченнойснаружипаройпервоначально примененных праймеров) [25].
Несмотря на это, исследованиес помощью QF-PCR смешенных образцов(более 10-20% примесипосторонней ДНК, например ДНК матери) нежелательно, что связано соспецификой диагностики с применением STR-маркеров. В случае выявленияанеуплоидий в смешенных образцах, в т.ч. при подозрении на мозаицизм,более целесообразно применять цитогенетический метод FISH.1.3.2 Хромосомный микроматричный анализВ последнее время для пренатального выявления анеплоидий все ширеприменяется метод молекулярного кариотипирования на микроматрицах.Хромосомный микроматричный анализ (ХМА) - современная альтернативатрадиционному кариотипированию [24]. Данный метод позволяет избежатьэтапа культивирования при диагностике по амниотической жидкости, приэтом с помощью данного метода можно не только выявлять анеуплоидии(трисомии,моносомии),нодиагностироватьсубмикроскопическиемикроделеции и микродупликации, которые не выявляются при обычномкариотипировании.
Для проведения хромосомного микроматричного анализаиспользуется твердый носитель небольшого размера (микроматрица) изстекла или кремния. В определенном порядке к нему прикреплены короткиеолигонуклеотиды (8-80 п.н.) или фрагменты ДНК (более 100 п.н.).Например, матрицы, используемые для хромосомного микроматричногоанализа американской компанией Affymetrix содержат до 2,7 млн.специфическихолигонуклеотидов(SNP-зонды).ПриобычномХМА20применяетсямикроматрицасреднейплотности(750тыс.зондов),микроматричный анализ высокого разрешения проводится с помощьюмикроматрицы высокой плотности (2,67 млн. зондов). Благодаря этому,удаетсяполучатьинформациюоналичии/отсутствиигенетическогоматериала со значительной части генома.
К недостаткам метода можноотнести невозможность выявлять сбалансированные транслокации, поэтомустандартныйцитогенетическийанализдифференциальноокрашенныххромосом не теряет своей актуальности.1.4 Инвазивные методы получения материала плода1.4.1 АмниоцентезВ настоящее время пренатальная диагностика ХА осуществляется спомощью различных инвазивных методов исследования тканей плодовогопроисхождения: хориона, амниотической жидкости, крови плода и др. Еепоявлению в конце 1960-х годов способствовало описанное выше развитиегенетики соматических клеток, позволившее создать метод изучениякариотипа плода, основанный на исследовании амниотической жидкости,получаемой посредством пункции околоплодного пузыря (амниоцентеза).Впервые амниоцентез был применен с целью лечения многоводия во второйполовине XIX века.
В 1956г. американский акушер F. Fuchs и датскийгастроэнтеролог P. Riis сообщили об успешном пренатальном определенииполового хроматина в клетках, полученных путем амниоцентеза [18]. В 1966М.W. Steel и W.R. Bregсмоглиустановить по культуре клетокамниотической жидкости кариотип плода [19]. В настоящее время обычноамниоцентез осуществляют с 16 недель беременности под контролем УЗИ.Количество извлекаемой амниотической жидкости (1-40 мл) зависит от срокабеременности и задач лабораторной диагностики.Частотапроцедуросвязанныхсоставляет 0,5-2% [20].осложненийпослеамниоцентеза211.4.2 КордоцентезДля пренатального определения кариотипа может быть использована икровь плода, которую получают с помощью пункции сосудов пуповины(кордоцентеза) [21]. Наиболее ранним гестационным возрастом плода, прикотором извлечение его крови в количестве 1 мл не ведет к осложнениям,является 16 недель беременности.
Поскольку в большинстве случаевтребуется большее количество крови, манипуляцию проводят в болеепоздние сроки, вплоть до 27 недель беременности. Как правило, количествоаспирированной крови колеблется от 1 до 5 мл. Частота процедуросвязанныхосложнений после кордоцентеза не превышает 2% [20].1.4.3 Биопсия хорионаС конца 1970-х годов начал широко применяться еще один способполучения ткани в I триместре беременности - биопсия ворсин хориона,впервые примененный отечественными исследователями В.А.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
