Диссертация (1174340), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Это позволилопредположить, что ДНК плода в периферической крови матери может статьудачной альтернативой применению методов выявления анеуплоидий поядросодержащим клеткам плода.Следует отметить, что впервые об обнаружении внеклеточной ДНК вчеловеческой плазме крови стало известно уже в середине 20 века, еще дооткрытия структуры ДНК Уотсоном и Криком [54]. Это не было оценено подостоинству вплоть до того, когда повышенный уровень внеклеточной ДНКбыл выявлен в 1960-х годах у больных с системной красной волчанкой, апозднее - у онкологических больных [55].1.7.2 Происхождение и характеристики материнской внеклеточной ДНКВнеклеточныепериферическойнуклеиновыекрови,ноикислотывсодержатсядругихжидкостяхнетолькоорганизмав(вспинномозговой жидкости, лимфе, желчи, моче, мокроте и т.д.), онипредставлены помимо геномной также митохондриальной ДНК, вируснойДНК и РНК, информационной РНК, микроРНК.
Концентрация свободнойДНКуздоровыхдоноровнаходитсявпределах10-100нг/млплазмы/сыворотки. Изменение концентрации внеклеточной ДНК может быть33ассоциировано с развитием онкозаболеваний, а также связано с физическиминагрузками,травмами,инфекционнымизаболеваниями,инсультом,инфарктом, беременностью [56].Внеклеточная ДНК содержится в жидкостях организма во внеклеточныхвизикулах (в виде апоптозных телец, микрочастиц, микровезикул и экзосом),в виде комплексов ДНК с гистонами или нуклеосом,ДНК/РНК-липопротеинового комплекса (виртосом) [57].По мнению одних исследователей, основной причиной появлениявнеклеточной ДНК является некроз тканей [58,59].
По версии других апоптоз, в пользу этойверсии говорит размер фрагментов ДНК,детектируемых в плазме [60,61]. Некроз и апоптоз - два различных видагибели клеток. Некроз вызывает насильственная гибель от повреждения,апоптоз - запрограммированная клеточная смерть. Некроз распространензначительно меньше, чем апоптоз и может индуцироваться тяжелыминеобратимымиионизирующегоповреждениями, такимиизлучения,воздействиекак инфаркт,высокие дозыповреждающихклеточнуюмембрану веществ, блокировка энергетических процессов в клетке.
Некрозхарактеризуется конденсацией хроматина, увеличением размера клетки с еепоследующим лизисом. По всей вероятности, в здоровом организмепоявление свободной ДНК во внеклеточных жидкостях связано с процессомапоптотической гибели клеток, который начинает регистрироваться сраннего эмбриогенеза. Некроз клеток, как источник свободной ДНК, повидимому, имеет в этом случае минимальное значение. [62].Предполагается, что в норме основным источником внеклеточной ДНКявляются гемопоэтические клетки, клетки иммунной системы.
Ежедневно ворганизме взрослого человека вступают в деление примерно 1011-1012 клеток,такое же количество клеток должно подвергаться апоптозу. Помимо этого, ворганизме человека каждый день продуцируется 1011 эритротцитов, иэнуклеированные ядра становятся потенциальным источником свободнойДНК в случае нарушения механизмов ее деградации в макрофагах,34непосредственно участвующих в фагоцитозе этих ядер. Описано влияние науровень внеклеточной ДНК ферментов нуклеаз, изменение активностикоторых и связанное с этим изменение уровней внеклеточной ДНКустановлено при разных патологиях [63].Молекулярные пути, ведущие к индукции апоптоза, разделяют на два: навнешний и внутренний. Внешний путь апоптоза ведет к гибели клетки,индуцированной внеклеточными сигналами, обусловленными связываниемлигандовсоспецифическимитрансмембраннымирецепторами,называемыми рецепторами смерти, которые относятся к семейству TNF/NGF.Внутренний апоптоз представляет собой ответ клеток на ряд стрессирующихусловий, включающих повреждение ДНК, оксидативный стресс и многиедругие факторы.
Так или иначе, но оба эти пути апоптоза связаны с запускомферментного каспазного каскада, активация которого и обуславливаетпроцессыконечныхцистеиновыестадийпротеазы,апоптозакоторые(каспазыпредставляютрасщепляютсобойаминокислотныепоследовательности) [64].Деградация клеточной (хромосомной) ДНК в процессе апоптоза клетокпроходит две стадии: сначала ДНК расщепляется в нуклеосомных единицахапоптотических клеток ферментом ДНКазой, активированной каспазой;после поглощения макрофагами апоптотических клеток ДНК деградирует донуклеотидов в лизосомах с помощью фермента ДНКазы II. Последнийотвечает также за деградацию ДНК из эритроидных предшественников вкостном мозге и фетальной печени, что в случае фетальной печенисвидетельствует о наличии апоптоза в эмбриогенезе, когда печень являетсяярко выраженным гемопоэтическим органом [65].Сложно переоценить значение патогенетической роли апоптоза. Повидимому,всеосновныезаболеваниячеловека(атеросклероз,онкологические, нейродегенеративные и аутоиммунные заболевания и др.) вбольшей или меньшей степени связаны с нарушениями в механизмахапоптозаклеток,либосувеличением,либосуменьшениемего35интенсивности.
Несомненно, что нарушения эти напрямую будут связаны снарушениями в механизмах удаления продуктов клеточной гибели, т.е. сфагоцитарной активностью разных клеточных элементов.Имеющиеся данные свидетельствуют об активном участии макрофаговв процессах фагоцитирования клеток, погибающих в результате апоптоза илинекроза. При этом оказалось, что погибающие клетки не пассивновысвобождают ДНК в циркуляцию, а для этого необходимо активноевзаимодействие клеток с макрофагами.
Показано, что в условиях in vitro безмакрофагов некротические клетки вообще не высвобождают ДНК всвободном виде. Можно предположить, что в отсутствие макрофагов или приихнарушеннойфункцииклеточныематериалыперевариваютсянеполностью, и та же ДНК может находиться в составе нуклеосом. С другойстороны, при определенных количественных взаимоотношениях междумакрофагами и некротическими (или апоптотическими) клетками макрофагисами подвергаются апоптозу, что и может стать причиной отсутствиямеханизмов расщепления ДНК и появления ее в свободном виде [66].Причиной гибели макрофагов может стать фагоцитоз макрофагамибактерий с последующим подъемом уровня внеклеточной ДНК [67]. Покрайней мере, следует признать за устоявшийся факт, что появлениевнеклеточной ДНК является результатом не просто апоптоза или некрозаклеток, а результатом активного взаимодействия клеток с макрофагами споследующим появлением в циркуляции их внеклеточной ДНК.
Возможно, сактивностью макрофагов связаны различные размеры внеклеточной ДНК,которые значительно меньше у внеклеточной ДНК из апоптотическихклеток, чем из некротических [60].1.7.3 Происхождение и характеристики плодовой внеклеточной ДНКИсточником плодовой внеклеточной ДНК в периферической кровибеременныхявляетсяапоптозклетоктрофобласта,плацентыи36гемопоэтических клеток плода [68,69,70]. При этом циркулирующая вматеринском кровотоке плодовая ДНК представлена фрагментами длиной100-160 п.н., что в среднем на 20 п.н. короче, чем фрагменты внеклеточнойДНК материнского происхождения [71].
Как оказалось, размер внеклеточнойДНК как плодового, так и материнского происхождения кратен размерувиткавокругнуклеосомы,чтоубедительноподтверждаеттеориюапоптотического происхождения внеклеточной ДНК, а также позволяетобъяснить разницу в их длине [72]. Зависимость длин фрагментоввнеклеточной ДНК от структуры нуклеосом представлена на рисунке 3.Рисунок 3. Распределение фрагментов ДНК по размерам.ДНК плода обозначена синей линией, общая ДНК - красной,митохондриальная ДНК - зеленая пунктирная линия. Числа над пикамиобозначают размер ДНК в парах нуклеотидов.
Над графиком приведеносхематическое изображение структурной организации нуклеосомы. Слева37направо показана двойная спираль ДНК вокруг нуклеосомного ядра ссайтами расщепления нуклеазами; ядра нуклеосом с накрученной вокруг нихмолекулой ДНК. Эти данные свидетельствуют о том, что фрагментывнеклеточной ДНК образуются в результате ферментативной обработки ДНКапоптотических клеток, а не в следствие некроза [72].Фетальная ДНК начинает определяться в крови матери, начиная с 5-йнедели беременности, при этом её доля в общей массе внеклеточной ДНКможет зависеть от множества факторов [73,74].
Содержание фетальной ДНКвозрастает на протяжении всей беременности. В исследовании более 22 тыс.образцов плазмы крови беременных с одноплодной беременностью,полученных на разных сроках гестации, было показано, что с 10-й по 20-юнеделю беременности внеклеточная ДНК в среднем содержит 10% ДНКплода и доля фетальной ДНК увеличивается на 0,1% в неделю; начиная с21-й недели, она растет в среднем уже на 1% в неделю [75]. Также доляфетальной ДНК отрицательно коррелирует с весом матери. Было показано,что в среднем для матери с весом в 60 кг доля фетальной ДНК составляет12%, в то время как при весе 120 кг - только 6% [73].
Это может быть связанос ростом концентрации внеклеточной ДНК в кровотоке по мере увеличениявеса матери, при том, что количество ДНК плода остается на прежнемуровне. Полагают, что увеличение количества материнской ДНК происходитпо причине повышения уровня смертности клеток жировой ткани имакрофагов в результате метаболической и иммунологической дисфункции[76]. Другим объяснением может быть разведение плодовой ДНК, связанноес увеличением объема крови матери [75]. Содержание ДНК плода в кровиматери снижается также после физических нагрузок, предположительно засчет увеличения количества материнской ДНК, связанного с процессамимеханического повреждения мышц, а также с повреждением ДНК врезультате окислительного стресса [71, 77].Было показано, что на сроке 11-13 недель беременности, в среднем попопуляции медианное значение концентрации фетальной ДНК составляет3811,4%, при этом значительной разницы для случаев с нормальнойбеременностью и для плода с трисомией не наблюдается [73, 75].
Доляфетальной ДНК не зависит от возраста, национальности, курения, полаплода, а также продолжительности хранения плазмы после её получения [73].1.7.4 Определение доли плодовой ДНКНаличие фоновой материнской ДНК значительно затрудняет анализплодовой ДНК в крови матери. Поэтому крайне важно установить её долюотносительно доли ДНК матери в каждом конкретном случае. Это позволяетоценить достоверность получаемых в ходе исследования клиническихрезультатов и позволяет избежать ложноотрицательных результатов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
