Диссертация (1174340), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Какотмечалось выше, доля плодовой ДНК положительно коррелирует со срокомгестации и отрицательно с весом матери [70]. Cнижение достоверностиполучаемых результатов при выявлении трисомий у плода обычнонаблюдается при содержании доли плодовой ДНК менее 4%, при этом с 10по 20 неделю беременности менее 4% плодовой ДНК содержат примерно 2%образцов [78]. Такие образцы требуют повторного забора крови на болеепоздних сроках гестации. Было показано, что при повторном заборе крови (всреднем интервал между двумя заборами составлял 27 дней) доля плодовойДНК увеличивается в среднем на 1% и для более половины образцовсоставляет выше 4% [75].Для установления доли плодовой ДНК могут применяться локусыДНК, которые имеются у плода и отсутствуют у матери.
Например, такимилокусами могут быть локусы хромосомы Y при беременности плодоммужского пола или ген RHD (Rhesus D) у беременной с резус-отрицательнойпринадлежностью крови. Определение наличия Y хромосомы и гена RHDчасто применяется в клинической практике, однако таким способом можноопределить концентрацию плодовой ДНК лишь у половины беременных[79,80,81]. Поэтому разрабатываются и другие способы установления доли39плодовой ДНК в материнском кровотоке, не зависящие от пола и резусфактора плода, которые также основаны на обнаружении различий междуДНК матери и плода.
Одним из методов является определение доли ДНКплоданаоснованиипрофиляметилирования.Методоснованнаэпигенетических различиях между плодовой и материнской ДНК, а именнона различиях в метилировании ДНК матери и плода. В качестве маркеровиспользуются гиперметилированные гены у плода и гипометилированные уматери, что позволяет использовать чувствительные к метилированиюрестриктазы, которые специфично разрушают неметилированную ДНКматери и не действуют на гиперметилированную ДНК плода. Послеобработки данным ферментом становится возможной специфичная детекциясвободной ДНК плода методом ПЦР реального времени [82,83,84].
К другимспособам относятся выявление унаследованных от отца мутаций, анализполиморфизмапринципиальнаятандемныхповтороввозможность[85,86].установленияТакжедолирассматриваетсяплодовойДНКсиспользованием информации о длине фрагментов внеклеточной ДНК [72,87].Следует отметить, что разделение материнской и плодовой ДНК в основномимеет значение только для установления доли плодовой ДНК, дляопределения изменения количества копий хромосом разделение материнскойи плодовой ДНК обычно не требуется. Однако, т.к. без установления долиплодовой ДНК невозможно оценить достоверность получаемых результатов,разработка надежных способов определения доли плодовой ДНК внезависимости от пола плода и их валидация продолжают оставаться крайнеактуальными задачами.1.7.5 Исследование внеклеточной ДНК с применением цифровой ПЦРПервые попытки использовать внеклеточную ДНК для определенияанеуплоидий у плода были предприняты в 2007 году с использованиемцифровой ПЦР (Digital PCR) [88].
В отличие от стандартной количественной40ПЦР, которая проходит в едином реакционном объеме, для проведенияцифровой ПЦР образец с помощью специального прибора случайнымобразомразделяютнабольшоеколичествоизолированныхмикрокомпартментов, так называемых микрореакторов. Для выявленияанеуплоидии с помощью цифровой ПЦР могут применяться различныеподходы:-измерениесоотношенияпредставленностиоднонуклеотидныхполиморфизмов с высокой гетерозиготностью, находящихся на конкретнойхромосоме.
Применимость этого метода зависит от генотипа матери;- cравнение представленности неполиморфных локусов, находящихсяна разных хромосомах. В этом случае удается избежать ограничений,связанных с генотипом матери;- использование эпигенетических маркеров, позволяющих отличитьплодовую свободноциркулирующую ДНК от ДНК матери.Помимо этого, возможна комбинация различных подходов.
Однако, внастоящее время метод выявления анеуплоидий плода по крови матери спомощью цифровой ПЦР имеет только теоретическое значение, т.к. неприменяется на практике.1.7.6 Полногеномное высокопроизводительное секвенированиеПоявление методов высокопроизводительного секвенирования (nextgeneration sequencing, NGS), ставшее возможным благодаря появлениюметодов,позволяющиходновременноопределятьпоследовательности(секвенировать) миллионы фрагментов ДНК, что позволило открыть внаучных и клинических исследованиях в области выявления анеуплоидий уплода по крови матери новую эру, как в исследовательском, так и впрактическом направлении [89]. Применяемые при высокопроизводительномсеквенированииотдельныетехнологиимолекулыспособныДНК,одновременнонезависимодруганализироватьотдруга.41Высокопроизводительное секвенирование, в отличие от цифровой ПЦР, нетребует априорных знаний об исследуемых последовательностях и позволяетиспользовать информацию от всех последовательностей внеклеточной ДНК вкровибеременной.Первымизиспользованныхметодовскринингаанеуплоидий, стал прямой подход, основанный на секвенировании всейвнеклеточной ДНК плазмы крови беременной женщины с последующимбиоинформационным анализом данных [90].Данный полногеномный подход основан на подсчете секвенированных входе проведения исследования фрагментов (ридов), приходящихся накаждую из хромосом и сравнения с аналогичными данными, имеющимисядля референсного набора хромосом.
Например, при доле плодовой ДНК 5%среди всей ДНК, в случае трисомии у плода по какой-либо хромосоме мыувидим увеличение числа фрагментов, относящихся к соответствующейхромосоме на 2,5%. Разбросы доли фрагментов, приходящихся на каждуюхромосому для референсных образцов, зависят от конкретной хромосомы иее GC состава. В ряде случаев возникает значительное искажение величиныпокрытия в зависимости от GC состава участка хромосомы. Для того чтобыуменьшить вариабельность данных связанных с этим эффектом применяютсястатистические модели, позволяющие скорректировать полученное покрытиес учетом GC состава фрагмента.
У 13, 18 и 21 хромосом, исследованиекоторых представляет особый интерес, разброс в значениях покрытияотносительнонебольшой.Помимопростогоподсчетаколичествафрагментов, приходящихся на каждую из хромосом, можно дополнительноучитывать информацию о размере секвенированного фрагмента ДНК.
Этовозможно благодаря тому, что распределение длин внеклеточной ДНКматеринскогоиплодовогопроисхождения,какуказывалосьвыше,отличается между собой [71,72,91,92]. Схема проведения исследования приподобном комбинированном подходе представлена на рисунке 4.42Рисунок 4. Определение анеуплоидий плода с помощью полногеномногоподхода. Секвенируются фрагменты внеклеточной ДНК крови матери,учитывается разница в длине у фрагментов плодовой и материнской ДНК. Вкачестве примера представлена частичная анеуплоидия хромосомы 2 [92].43Вне зависимости от используемой платформы, для дальнейшегосеквенирования необходимо приготовление библиотек, т.е.
совокупностифрагментовДНК,относящихсякодномубиологическомуобразцу,модифицированных соответствующим для применяемого метода образом.ОднимизэтаповобычноявляетсяфрагментацияДНК.Однако,приготовление библиотек при исследовании внеклеточной ДНК не требуетпредварительного разрушения ДНК, т.к. внеклеточная ДНК уже находится всильно фрагментированном состоянии. После этапа лигирования адаптеровпроводится этап амплификации ДНК для достижения необходимого длясеквенирования количества материала (обычно изначального количестваДНК недостаточно), затем этап клональной амплификации ДНК намикросферах/твердой подложке, для получения достаточного сигнала откаждоймолекулы[94].Применимостьосновныхплатформвысокопроизводительного секвенирования для ДНК-скрининга показанарядом авторов [90,95,96,97,98].
Два основных подхода, которые широкоиспользуютсяприДНК-скрининге(полногеномноеитаргетноесеквенирование) представлены на рисунке 5. При полногеномном подходесеквенируются все попавшие в образец молекулы ДНК, при таргетномподходесеквенированиеполногеномноеипроизводитсятаргетноевыборочно.секвенирование.A.ИзображеныПолногеномноесеквенирование использует статистический подсчет ридов, производимый спомощью эталонного (референсного) генома человека. B.
При таргентномсеквенировании анализируются конкретные локусы с однонуклетиднымиполиморфизмами (SNP; красные и синие звездочки). Материнские генотипыиспользуются для моделирования распределений аллелей для каждоговарианта плоидности и основаны на фактическом распределении SNP, расчетпроизводится на основе учёта вероятности каждой гипотезы.C. Вальтернативном подходе таргетного секвенирования выбранные фрагментыобогащаются и сопостовляются с геномом человека.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
