Диссертация (1174340), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Соотношения хромосомрассчитываются с помощью статистических методов [98].44Рисунок 5. Основные подходы, которые используются при ДНК-скрининге.1.7.7 Алгоритмы анализа данныхИзалгоритмованализаданных,используемыхприполногеномномсеквенировании внеклеточной ДНК с целью выявления хромосомных анеуплоидийу плода, наиболее известным алгоритмом является расчет параметра Z длякаждойисследуемойхромосомы[95,97].Этот подходоснованнапредположении, что доля фрагментов, приходящихся на каждую изхромосом, пропорциональна их исходному количеству и распределение45значения доли фрагментов, приходящихся на каждую из хромосом, являетсянормальным для образцов без анеуплоидии. Исходя из свойств нормальногораспределения для большинства эуплоидных образцов (более 99%) значенияZ будут лежать в интервале (-3,3).
При значении |Z| > 3 более вероятнымявляется предположение о том, что полученное значение не принадлежит квыборке нормальных образцов и верна гипотеза о наличии у плодаанеуплоидии. Допускается существование интервала значений, при которомриск наличия анеуплоидий не определен, например при 2,5 < |Z| < 3. Данныйподход не учитывает возможность наличия нестандартного количествакопий отдельных фрагментов ДНК у самой матери, что может приводить кложноположительным результатам, поэтому дополнительно анализируетсяне только Z для каждой хромосомы, но и Z для фрагментов длиной 5млн.п.н.
с шагом 50 тыс.п.н. Сравнение Z для всей хромосомы и медианызначений для отдельных фрагментов хромосомы позволяет выявлять случаиложноположительных результатов. Помимо этого, поскольку эффективностьсеквенирования отдельных фрагментов ДНК в значительной степени зависитот их GC состава, на этапе анализа данных проводят GC-коррекцию. Другойподход, используемый для определения риска наличия анеуплоидий сравнение покрытия проверяемой хромосомы с покрытием остальныххромосомвнутриобразцаипроверкастатистическойзначимостиобнаруженных отличий с использованием критерия Стьюдента (T-test) [96].Алгоритм анализа данных представлен на рисунке 6.46Рисунок 6. Алгоритм анализа данных при ДНК-скрининге с применениемполногеномного высокопроизводительного секвенирования.Преимуществомполногеномногоподходаявляетсявозможностьисследования всего генома, а не отдельных хромосом, что позволяет выявитьанеуплоидии по любой хромосоме.Также немаловажным являетсяспособность данного подхода без дополнительных модификаций процессапробоподготовки выявлять частичные анеуплоидии размером в несколькомиллионовпарнуклеотидов.Выявляемыеприэтомнестандартныеанеуплоидии в ряде случаев могут являться проявлением плацентарногомозаицизмаиприменятьсякакмаркерывозможногоосложнениябеременности, задержки развития плода, а также угрозы раннего прерываниябеременности.
Также они могут свидетельствовать о наличии начальных47стадийнекоторыхонкологическихзаболеваний.Однимиизсамыхактуальных задач, стоящих перед исследователями в настоящее времяявляются выяснение причин ложноположительных результатов, особенночасто встречающихся при выявлении нарушений по половым хромосомам, атакже разработка способов минимизации подобных случаев.К недостаткам полногеномного подхода относится невозможностьвыявления кратного нарушения хромосомного набора - триплоидии.
Однако,триплоидии практически не встречаются среди живорождённых детей.Обычно они являются причиной гибели эмбриона на ранней стадии развития,а если плод и доживает до срока более 10-11 недель беременности, то имеетмногочисленные врожденные дефекты, которые легко выявляются спомощью ультразвукового исследования.1.7.8 Таргетное секвенированиеАльтернативойсеквенирование(отполногеномному“target”–подходумишень,цель).являетсятаргетноеПодобныеметодыразрабатываются в первую очередь для удешевления исследования иоснованынавыборочном,“прицельном”секвенированииотдельныххромосом. В настоящее время опубликовано и используется в клиническойпрактике два варианта таргетного подхода.Первый подход разработан компанией Ariosa Diagnostics Inc., США (в2014 году о приобретении Ariosa Diagnostics Inc. сообщила швейцарскаяфармацевтическая компания Roche) и основан на выборочной амплификациии последующем секвенировании ограниченного числа локусов на каждойхромосоме, назван авторами цифровым анализом отдельных регионов (digitalanalysis of selected regions DANSR™) [99].
Для определения наличияанеуплоидий, разработаны олигонуклеотиды специфичные 384 локусам накаждой из исследуемых хромосом, с помощью которых в одной пробиркеамплифицируются целевые регионы, после чего проводится сравнение48покрытия локусов на исследуемых (21, 18, 13 и т.д.) хромосомах с покрытиемна всех остальных хромосомах. Достоверность определяется путем подсчетаZ-score. Для увеличения точности, помимо неполиморфных локусов,секвенируется небольшое количество полиморфных локусов, позволяющихоценивать долю плодовой ДНК, и проводить оценку наличия анеуплоидий сучетом этой информации [100].
После валидации определения наличияанеуплоидий методом NGS авторы перешли к использованию микрочипов[101,102], что позволяет снизить стоимость проведения исследования.Второй вариант таргетного подхода предложен компанией Natera Inc.,США (ранее - Gene Security Network) и основан на секвенированииоднонуклотидныхполиморфныхлокусов(SNP)[103,104].Послеамплификации с помощью мультилексной ПЦР примерно 20 000 локусовSNP, проводится секвенирование и подсчет представленности различныхаллелей в плазме крови беременной.
Дополнительно к этому, проводитсясеквенирование генома самой матери с помощью клеточной ДНК, а также,при возможности, и генома отца. При расчетах используется технологиясобственной разработки Parental SupportTM, которая использует полученнуюинформацию о генотипе родителей в сочетании с данными международногопроекта HapMap (сокращение от Haplotype Map, проект направлен наразработку гаплотипа генома человека). С помощью данных о генотиперодителей и данных о частоте встречаемости различных гаплотиповпроводится компьютерное моделирование миллиардов различных вариантовгенотипа плода, после чего выбирается наиболее достоверная модель.ПрименениеполиморфныхлокусовSNPпозволяетвыявлятькактриплоидию, так и случаи спонтанной редукции одного из эмбрионов, а приналичии материала отца - повышать точность анализа и снижать минимальнонеобходимое содержание плодовой ДНК.
Заявляется, что это позволяетпроводить анализ уже с 9 недель беременности [105]. При таргетном подходеснижается объем секвенирования по сравнению с полногеномным подходом,чтоуменьшаетсебестоимостьисследованияипозволяетувеличить49количествоисследуемыходновременнообразцов.Однако,принеобходимости исследования дополнительных локусов ДНК требуетсяразработка новых диагностических наборов. Также особенностью методаявляется необходимость знать генотипы родителей (как минимум генотипматери), чтобы выбрать полиморфизмы, подходящие для анализа поаллельной частоте и отделить реальные полиморфизмы от ошибоксеквенирования.1.7.9 Биологические ограничения ДНК-скринингаКак уже указывалось, наиболее вероятным источником плодовой ДНК вкровотоке матери являются клетки оболочек плода – трофобласта иплаценты.
При этом еще в 1983 г. стало известно о возможномнесоответствии между кариотипом оболочек плода и самого плода, т.е.плацентарном мозаицизме [106]. Несоответствие кариотипа плода срезультатами, полученными после проведения процедуры биопсии ворсинхориона (ограниченный плацентарный мозаицизм), как выяснилось вдальнейшем, явление не редкое, оно наблюдается в 1-2% случаев[1,107,108,109].ПодобныйложноположительныхмозаицизмрезультатовприможетявлятьсяпроведениипричинойДНК-скрининга[110,111]. Наличие анеуплоидных клеток и в тканях плода (в мозаичной илиполной форме), и в плаценте подтверждается в 10-11% ограниченногоплацентарного мозаицизма [107].
Причиной мозаицизма могут являтьсянарушения как в митозе, так и в мейозе. В первом случае зигота имеетнормальный кариотип, а нарушения числа хромосом возникают в процессепоследующих делений. В этом случае обычно в плаценте наблюдаютсяотдельные участки с трисомиями, при этом плод имеет нормальный кариотип(моносомные по аутосомам клетки обычно элиминируются). Во второмслучае изначально зигота имеет трисомный кариотип, а в процессеэмбриогенеза происходит элиминация лишней хромосомы. При этом50наблюдается высокая степень мозаицизма или же полная трисомия плаценты.Плод может иметь как нормальный, так и мозаичный кариотип.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
