Диссертация (1174340), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Алгоритмдополнительного анализа приведен в разделе “Определение происхожденияанеуплоидий при ДНК-скрининге”.742.3.8 Статистическая обработка материалаДля работы с файлами формата bam, содержащими информацию овыравниваниипрочитанныхфрагментовнареференсныйгеном,использовался программный пакет SAMtools и модуль Pysam для языкапрограммирования Python [155].
Статистический анализ данных проводили сиспользованием программных пакетов R (версия 3.2.2) и Microsoft Excel.Статистическую значимость относительного изменения доли плодовой ДНКопределяли с использованием критерия Манна-Уитни с поправкой нанепрерывность. Статистическую значимость разницы частоты встречаемостимозаичной формы моносомии определяли при помощи критерия Хи-квадратс поправкой Йетса. Статистически значимыми считали различия приp менее 0,05. Анализ данных секвенирования проводили с использованиемразработанного в лаборатории программного обеспечения.75Глава 3.
Результаты и обсуждение3.1 Скрининг наличия анеуплоидий3.1.1 Результаты валидацииВо всех 286 наблюдениях пациентов первой ретроспективной группы вобразцахтканейплодовогопроисхождения(хорион,плацента,амниотическая жидкость) был определен кариотип плода с помощьюстандартного цитогенетического метода, а периферическая кровь женщинбыла исследована на наличие анеуплоидий и Y-хромосомы у плода спомощью ДНК-скрининга анеуплоидий по крови матери.
Все беременныеимели высокий риск хромосомной патологии плода, обусловленныйвозрастом, изменениями в уровнях сывороточных маркеров, особенностямифенотипа плода. Подсчет рисков осуществлялся с помощью компьютерныхпрограмм Astraia и Prisca.закончилисьрождениемУ 11% женщин предыдущие беременностидетейсгенетическиминарушениямиилипрерыванием неразвивающейся беременности с анеуплоидией у плода; 7%женщин страдали привычным выкидышем. У 13% беременность наступилапосле ЭКО, донорства яйцеклетки не было ни в одном случае.
У 5% женщинв родословной отмечены случаи наследственной и врожденной патологии ублизких родственников.Доля плодовой ДНК в материнском кровотоке является крайне важнымкритерием валидности ДНК-скрининга. В проведенном нами исследованиисреднее содержание доли плодовой ДНК в 1918 образцах составило 11,6%(90% доверительный интервал составил от 6,6% до 17,5%). В пяти образцах в1-й группе валидации уровень плодовой ДНК был менее 4%, в связи с чемонибылиисключеныиздальнейшихрасчетовдиагностическиххарактеристик ДНК-скрининга. Важно отметить, что при этом в двухобразцах с низкой долей плодовой ДНК не были выявлены трисомии по 21хромосоме (ложноотрицательный результат), что подтвердило важность76оценки доли плодовой ДНК для получения валидных результатов ДНКскрининга.РезультатыбиоинформатическогоанализаданныхДНК-скрининга в 1-й группе валидации представлены на рисунке 15.
ЗеленымРисунок 15. Результаты биоинформатического анализа данных НИПС.цветом обозначены образцы с нормальным количеством хромосом, красным- с наличием анеуплоидии по 21, 18 и 13 хромосомам.Данные исследования первой ретроспективной группы представлены втаблице 3. Исключены 5 образцов с низкой долей ДНК плода.Таблица 3. Результаты выявления анеуплоидий для первой ретроспективнойгруппы.N=281Вид хромосомногонарушения.Трисомия 21Трисомия 18Трисомия 13По всем половымхромосомамРезультатыНИПСПодтвержденокариотипомЛожнопозитивныеЛожнонегативные161510441934419200100077При исследовании первой ретроспективной группы, сопоставлениеполученных обоими методами результатов показало, что в 279 из 281 (99%)случаях данные цитогенетического исследования совпадают с результатамиДНК-скрининга.ВсегоспомощьюДНК-скринингавысокийрисканеуплоидий по 21, 18, 13 и половым хромосомам был установлен в 82случаях, из них трисомия 21 - 44 наблюдения, трисомия по 18 хромосоме – 19наблюдений, трисомия по 13 хромосоме – 3 наблюдения, нарушения пополовым хромосомам 16 наблюдений.
Получен один ложноположительныйрезультат по 13-й хромосоме и один положительный результат привыявлении моносомии хромосомы Х.Результаты выявления анеуплоидий для второй ретроспективнойподгруппы представлены в таблице 4.Таблица 4. Результаты выявления анеуплоидий для второй ретроспективнойгруппы.N=63Вид хромосомногонарушенияТрисомия 21Трисомия 18Трисомия 13По всем половымхромосомамРезультатыНИПСПодтвержденокариотипомЛожнопозитивныеЛожнонегативные110015601560000000При исследовании второй ретроспективной подгруппы, сопоставлениеполученных обоими методами результатов показало, что во всех 63 случаях(100%) данные цитогенетического исследования совпадают с результатамиДНК-скрининга.
Всего с помощью НИПС высокий риск по 21, 18, 13 иполовым хромосомам был установлен в 22 случаях.Результатывыявленияанеуплоидийдляпроспективнойгруппыпредставлены в таблице 5. Исключены 10 образцов с низкой долей плодовойДНК.78Таблица 5. Результаты выявления анеуплоидий для проспективной группы.N=1145Вид хромосомногонарушенияТрисомия 21Трисомия 18Трисомия 13По всем половымхромосомамРезультатыНИПСПодтвержденокариотипомЛожнопозитивные169713041404000Ложнонегативные1000При проведении проспективного исследования при уровне плодовойДНК менее 4% производился повторный забор крови. Уровень плодовойДНК ниже 4% после перезабора крови наблюдался в 10 случаях (0,87%).
Этомогло быть связано как с осложненным течением беременности, так и сприемом женщиной лекарственных препаратов. Например, устойчиво низкийуровень плодовой ДНК наблюдался нами в случае приема женщинойпреднизолона и метипреда после операции тимэктомии.При исследовании проспективной группы, сопоставление полученных спомощью НИПС и цитогенетическим методом результатов показало, что в1137 из 1145 (99%) случаях данные цитогенетического исследованиясовпадают с результатами ДНК-скрининга. В результате проспективногоисследования было обнаружено 13 образцов с высоким риском трисомии по21 хромосоме, 4 образца с риском трисомии по 13 хромосоме, 8 образцов сриском моносомии Х, 1 образец с риском трисомии по Х хромосоме. Всетрисомии по аутосомам были подтверждены инвазивной диагностикой.Моносомия по Х хромосоме была подтверждена в трех случаях, в одном изних ребенок имел мозаичный кариотип.
У одного плода в результатеинвазивной диагностики был обнаружен мозаичный кариотип 47,ХХХ/46,ХХпри высоком риске моносомии Х по данным ДНК-скрининга, это может бытьобъяснено ошибками на этапе митоза и образованием трёх клонов клеток. Вслучае с высоким риском трисомии по Х хромосоме, был подтверждентрисомный кариотип у матери, исследование кариотипа плода не проводили.Ложноотрицательнй результат, полученный при выявлении трисомии 21,связан с мозаицизмом у плода, характеризующимся наличием трех клонов79клеток:моносомного, нормального(дисомного)итрисомного.Приисследовании новорожденного методом FISH для 21 хромосомы былообнаружено 77 (76%) ядер с 3 сигналами, 18 ядер (18%) с 2 сигналами и 6(6%) ядер с 1 сигналом.Обобщенные результаты выявления анеуплоидий с помощью ДНКскрининга для проспективной и перспективной групп представлены втаблице 6.Таблица 6.
Обобщенные результаты по всем группам, N=1489.ВиднарушенияРез-тыНИПСПодтв.кариот.Ложн.позит.Ложн.негат.Чувствительность, %98,6Специфичность, %100Положительн.предиктивнаяоценка (PPV)Отрицательн.предиктивнаяоценка (NPV)100100Трисомия 21727301(92,6-100)(99,7-100)(95-100)(99,6-100)Tрисомия 18252500(86,3-100)(99,8-100)(86,3-100)(99,8-100)Tрисомия 137610(59-100)(99,6-100)(47,4-99,7)(99,8-100)45X251870По всемполовымхромосомам(78,2-100)(99-99,8)(45,1-86,1)(99,8-100)332580100100100100(86,3-100)10099,999,599,5(98,9-99,8)10087,57275,8(57,7-88,9)100100100100(99,8-100)Всего с помощью ДНК-скрининга высокий риск анеуплоидий по 21, 18,13 и половым хромосомам был установлен в 137 случаях, из них трисомия 21- 72 наблюдения (совпадает с кариотипом во всех наблюдениях), трисомия по18 хромосоме – 25 наблюдений (также совпадает с кариотипом во всехнаблюдениях), трисомия по 13 хромосоме – 7 наблюдений (один случайложноположительный), риск нарушений по половым хромосомам былустановлен в 33 случаях, подтвержден кариотипом в 25 случаях.
При анализеполовых хромосом все образцы, в которых определялась Y-хромосома, былиотнесены к мужскому полу. Все отрицательные по Y-хромосоме образцырассматривались как относящиеся к женскому полу. Моносомия хромосомыХбылаопределенав23наблюденияхиподтвержденаданнымицитогенетического анализа в 18. В семи случаях был получен результат,80трактуемый как моносомия хромосомы X при наличии у плода нормальногоженского кариотипа 46,ХХ.Таким образом, ложноположительные результаты наблюдались привыявленииподаннымДНК-скринингавысокогорискамоносомиихромосомы X, а также высокого риска трисомии по 13 хромосоме.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
