Диссертация (1174336), страница 20
Текст из файла (страница 20)
В нашей работе,были исследованы полиморфизмы геновструктурных белков (коллагена COL3A1, ламинина LAMC1), генов цитокиновойсистемы (IL10, IL8, IL1B), генов, играющих центральную роль в регуляцииангиогенеза (VEGFA), генов эстрогеновых рецепторов (ESR1), и,генов,участвующих в гомеостазе соединительной ткани, а именно полиморфныевариантыгеновметаллопротеиназиихингибиторов(TIMP2,MMP2,MMP3,MMP9).С целью изучения генетических основ формирования ДСТ у детей с МВ,нами была использована диагностическая скрининговая панель, включающаяполиморфизмы следующих генов: COL3A1 (2029(2209)G>A), LAMC1 (-2204C>T), MMP2 (-1306 C>T),MMP3 (-1171 5A>6A), MMP9 (836 (855) A>G), MMP9(11562 C>T), VEGFA (-634 (-94) G>C) VEGFA (936 C>T),IL-10 (1082 A/G), IL-8(251 A>T), Ilβ (-511 C>T), ESR1 (-397 T>C),ESR1 (2014 G>A), ESR1(351 G>A),TIMP2rs2277698(A>C).БылисследованыобразцыДНКдетейсмуковисцидозом и образцы ДНК здоровых людей из коллекции Биобанка(случайный популяционный контроль) генетической лаборатории ФГБУНМИЦАГиП им.
ак. В.И. Кулакова. Из всей исследованной панели, у детей с136муковисцидозом, был выявлен полиморфизм гена металлопротеиназы 3 типа(MMP3 -1171insA, rs3025058). Идентификация данного полиморфного вариантаявляется интересным и прогностически важным фактом, так как на примередругихотечественныхисследований,проведенныхнапациентахснедифференцированными формами дисплазии соединительной ткани, доказанароль данного полиморфизма в качестве модификатора диспластическихизменений [7,62,64].
В иностранных молекулярно-генетических исследованияхизучен биологический эффект наличия данного полиморфизма в промоторнойобласти гена ММР3. В генно-инженерных экспериментах показано, чтопромоторная конструкция, содержащая 6А-аллель, обеспечивает более низкийуровень экспрессии гена-репортера по сравнению с аллелем 5А.
Подобныеразличия в характере экспрессии гена ММР3, зависящие от состояния 5А/6Асайта, сохраняются в культуре фибробластов и гладко-мышечных клетокбронхов, сосудов, фибробластов печени. Таким образом, гомозиготы по аллелю6А имеют самые низкие уровни стромелизина 1 в клетках (стромелизин -1 илиметаллопротеиназа 3 типа деградирует коллаген I, III, IV, V, IX, X и XI типов,протеогликаны, ламинин, фибронектин, желатины, эластин и другие белкимежклеточного матрикса) [70].Характер экспрессии гена ММР3, по всейвидимости, играет определяющую роль в ремоделировании сосудов, бронхов,паренхимы печени. Факт того, что в настоящем исследовании был обнаруженполиморфизм лишь в одном гене, может свидетельствовать о том, что приклинически выраженной ДСТ у пациентов с МВ, по всей видимости, играют рольдругие гены соединительной ткани, не вошедшие в скрининговую панельисследования.Частота встречаемости данного полиморфного варианта (MMP3 -1171insA) в общей выборке составила: 46,8% (n= 86) - аллель 6А в гетерозиготномсостоянии (генотип 5А/6А), у 19,9% (n=37) - аллель 6А встречалась вгомозиготном состоянии (генотип 6А/6А), и у 33,3% (n=62) - полиморфныйвариант аллели отсутствовал (генотип 5А/5А).
Общая аллельная частота (аллеля6А) в выборке составила- 43,3%. В группе контроля, составляющую 315 человек,137популяционную выборку здоровых женщин и детей, проходивших обследованиев Центре акушерства и гинекологии им. В.И. Кулакова, встречаемостьисследуемого полиморфизма была следующей. Среди матерей частотавстречаемости аллеля 6А: 5А/5А - 23% (n=41), 5А/6А - 48 % (n=85), 6А/6А - 28%(n=50). Среди детей полиморфный аллель 6А не встречался в 21 % (29 детейимели генотип 5А/5А), встречаемость 6А в гетерозиготном положении (5А/6А) –составила 52 % (n= 72), 6А в гомозиготном положении (6А/6А) - 27 % (n=38).Данные представлены в таблице 3.30 и рисунках 3.27, 3.28 (а-в).Таблица 3.30- Частота встречаемости полиморфизма MMP3 -1171insA висследуемой выборке и группе контроляГруппы5А/5АГенотипы5А/6А6А/6АДети с муковисцидозом, в исследуемойвыборке (n= 186)62 (33,3%)87 (46,8%)37 (19,9%)Матери, группа контроля (n=176)41 (23%)85 (48%)50 (28%)Дети, группа контроля (n= 139)29 (21%)72 (52%)38 (27%)87907280708562605040дети с муковисцидозом(n=186)5041здоровые дети (n= 139)37 382930матери (n= 176)201005А/5А5А/6А6А/6АРисунок 3.27 - Частота генотипов MMP3 -1171insA у детей с муковисцидозом ив группе контроля138Рисунок а.
Исследуемаявыборка детей смуковисцидозом (n=186)Рисунок б.Группа контроля (дети, n= 139)37; 20%62; 33%5А/5А38; 27% 29; 21%5А/5А72; 52%5А/6А5А/6А87; 47%6А/6А6А/6АРисунок в.Группа контроля (матери, n= 176)50; 29%41; 23%85; 48%5А/5А5А/6А6А/6АРисунок 3.28 (а-в) - Частота генотипов MMP3 -1171insA у детей смуковисцидозом и в группе контроляИз представленных диаграмм, видно, что частота встречаемостиполиморфизма MMP3-1171 insA практически совпадает с популяционнымиданными (российской популяции). При сравнении с группой матерей,достоверных различий по встречаемости полиморфизма не выявлено (p = 0,051,критерий ꭓ- квадрат).
При проведении сравнительного анализа исследованнойвыборки с контрольной группой детей, получены следующие различия: уздоровых детей полиморфный вариант аллеля-6А в гетерозиготном положении(генотип 5А/6А), встречается достоверно чаще, чем у больных муковисцидозом(p = 0,035, критерий ꭓ- квадрат).139Встречаемость данного полиморфизма в группах в исследуемой выборке,представлена в таблице 3.31. При проведении сравнительного анализавстречаемости генотипов 5А/6А и 6А/6А в группах (при сравнении I,II и IIIгруппы с IV) , достоверных различий выявить не удалось (p = 0,388, критерий ꭓквадрат, OR = 0,76, OI = 1,1-2,5).Таблица 3.31 – Частота встречаемости MMP3-1171 insА в исследуемыхгруппахГруппыI группа (n=72)II группа (дети с циррозом печени,n=21)III группа (дети с тяжелойбронхолегочной патологией ициррозом печени, n=26)IV группа (дети со среднетяжелымтечением муковисцидоза, n=67)5А/5А23(31,9%)7 (33,3%)7(26,9%)25(37,3%)Генотипы5А/6А31(43,1%)12(57,1%)14(53,8%)30(44,8%)6А/6А18(25,0%)2 (9,5%)Аллельнаячастота46,5%38%5 (19,2%)46%12(17,9%)40%3.3.2 Влияние полиморфизма MMP3-1171 insA на формирование ДСТПри анализе выраженности признаков дисплазии соединительной ткани взависимости от генотипа MMP3-1171 insA, было обнаружено, что у детей сгенотипом6А/6А(дваполиморфныхаллеля),выраженностьсоединительнотканной дисплазии была достоверно выше, чем у детей сотсутствием полиморфизма- генотип 5А/5А (р<<0,001).
Также и пригетерозиготном носительстве полимофризма MMP3-1171 insA (генотип 5А/6А)средние значения суммарного балла достоверно превышали средний балл удетей с отсутствием полиморфизма (р<<0,001). Полученные результатысвидетельствуют об ассоциации локуса 6A MMP3-1171 insA с развитием тяжелыхдиспластических изменений у детей с муковисцидозом (см. таблицу 3.32).140Таблица 3.32 - Выраженность ДСТ в зависимости от генотипа MMP3-1171 insA(5А/6А), Me [Q1;Q3]РаспределениеГенотипы гена ММР3баллов5А/5А (отсутствие полиморфизма)24 [18; 43]5А/6А (наличие одного полиморфного аллеля)41 [31; 52]6А/6А (два полиморфных аллеля)48 [37; 61]p-значениеp << 0,001На рисунке 3.29 проиллюстрировано степень выраженности ДСТ, взависимости от наличия полиморфизма MMP3-1171 insA.p<<0,001Рисунок 3.29 – Степень выраженности ДСТ, в зависимости от наличияполиморфизма ММР3При проведении анализа встречаемости полиморфизма MMP3-1171 insA взависимости от частых мутаций гена CFTR, достоверных различий выявить неудалось.
Аллельная частотаисследуемого полиморфизма в гене MMP3 упациентов с мутациями I-III классов - 44% (р=0,201 (ꭓ-квадрат)), у пациентов смутациями IV-V классов - 55% (р=0,271 (ꭓи-квадрат)).1413.3.3 Анализ возможности применения балльной шкалы в выявленииполиморфизма MMP3-1171 insAС целью изучения возможности применения балльной оценки ДСТ ввыявлении полиморфизма MMP3-1171 insA было выполнено построение двухматематических моделей с последующей оценкой их точностных характеристик.Первая математическая модель основывалась только на данных суммарногобалла по модифицированной балльной шкале.
Путем варьирования пороговогозначения суммы баллов была предпринята попытка найти такое значение суммы,при котором были бы оптимальными частоты верно определенных случаев сполиморфизмом и без него - то есть, собственно, показатели чувствительности испецифичности. Для этого была построена ROC-кривая, отображающаяизменения чувствительности и специфичности по мере вариации пороговогобалла (см. рисунок 3.30). Площадь под кривой составила 0,744 (ДИ 0,660-0,828),что позволило охарактеризовать качество модели как умеренное.Рисунок 3.30 - ROC-кривая при построении модели только по даннымсуммарного балла142Наиболее оптимальной точкой отсечения являлось пороговое значение в26 баллов, применение которого позволило верно выявить 112 из 124 детей сполморфным вариантом гена в гомо- или гетерозиготном состоянии (90,3%) и 38из 62 детей без полиморфизма (61,3%) (см. рисунок 3.31). Таким образом,чувствительность и специфичность модели при использовании порога в 26Значения чувствительности испецифичностибаллов составили 90,3% и 61,3% соответственно.1,00,80,60,40,20,051525354555657585Суммарный балл по шкале КадуринойЧувствительностьСпецифичностьРисунок 3.31 - Изменение чувствительности и специфичности при вариаципорогового уровня вероятности, определяемой по модели по даннымсуммарного баллаКлиническая интерпретация данной модели заключается в следующем.Выделение в «группу высокого риска» детей с суммарным количеством балловболее 26 позволит обнаружить 90,3% случаев с полиморфизмом MMP3 средивсей гипотетической группы детей с ДСТ, муковисцидозом и полиморфнымвариантом генаMMP3 (чувствительность модели).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
