Диссертация (1174326), страница 12
Текст из файла (страница 12)
= − ∑( + + )Где:ISA-intervillousspacearea,удельнаяплощадьмежворсинчатогопространства;MFA – microscopic field area, площадь микрофотографии;VTA – villous total area, площадь ворсин;FTA – fibrinoid total area, площадь фибриноида;SKA - syncytial knots area, площадь синцитиальных почек.Удельная площадь сосудистого русла (vascular density) определялась какотношение площади сосудов (vascular total area) к площади микрофотографии вцелом (microscopic field area).
=Где:VasD – vascular density, удельная площадь сосудов;VasTA – vascular total area, площадь сосудов;62MFA – microscopic field area, площадь микрофотографии.Для оценки васкуляризации ворсин рассчитывалось сосудисто-стромальноесоотношение (ССС) (capillarization index). = − Где:CI – capillarization index, сосудисто-стромальное соотношение;VilD – villous density, удельная площадь ворсин;VasD – vascular density, удельная площадь сосудов.Описанные выше показатели оценивались на 6 полях зрения на стекло.Соответственно, морфометрическая оценка проведена на 36 полях зрения в случаекаждой изучаемой плаценты.При микроскопическом изучении образцов ткани оценивалась доляпатологических участков плацентарной ткани, таких как истинные инфаркты, зоныафункциональных ворсин, участки массивного отложения межворсинчатогофибриноида [41].
Под истинными инфарктами плаценты понимают участкинекроза плацентарной ткани, связанные с облитерацией просвета или тромбозомматочно-плацентарныхартерий.Даннымучасткамприсущсегментарныйхарактер, они занимают один или несколько котиледонов, характеризуютсянекрозом синцитиотрофобласта и стромы ворсин, запустеванием плацентарныхсосудов. Зоны афункциональных ворсин представлены участком сближенныхворсин с сохранным эпителием и без прослоек фибриноида между ними.Выраженностьафункциональныхпатологическихворсин,участкиизменениймассивного(инфаркты,отложениязоныфибриноида)оценивалась полуколичественно по данным 9 микрофотографий (окраскагематоксилином-эозином, ув. об.
х 10).Разработана методика полуколичественной оценки доля патологическихизменений с помощью програмного обеспечения ImageScope M.63На каждой микрофотографии удельная площадь патологических измененийоценивалась по следующей формуле: =где:PSA – pathology site area, удельная площадь патологических участков;TPSA – total pathology site area, площадь патологических участков;MFA – microscopic field area, площадь микрофотографии.Далее по указанной ниже шкале присваивался балл:0 баллов – не более 5% от общей площади изображения;1 балл – от 5% до 20%;2 балла – от 20% до 35%;З балла – от 35% до 50%.Затем высчитывался средний балл для каждой плаценты по указанной нижеформуле.∑9=1 =9где:MAPS – mean area of pathology site, среднее значение доли патологическихучастков для отдельной плаценты;PSA – pathology site area, удельная площадь патологических участков, баллы.В заключении, рассчитывались средние значения каждого указанного вышерасчетного показатела по группам.ИммуногистохимическоеопределениеэкспрессииVEGF-Aвплацентарной тканиДля иммуногистохимической оценки экспрессии сосудисто-эндотелиальногофакторароставплацентарнойтканибылииспользованыпервичные64поликлональные кроличьи антитела к сосудисто-эндотелиальному фактору роста(VЕGF-A).
Параметры использованных антител представлены в табл. 3.Таблица 3. Параметры первичных антителНаименованиеРабочее разведениеПроизводительVEGF1:100Thermo (UK)Дляиммуногистохимическогоанализабылиотобраныблоки(безвыраженного отложения фибриноида и участков некроза в плацентарной ткани), скоторых изготавливали срезы толщиной 3-4 мкм. Полученные срезы монтировалина предметные стекла с адгезивным покрытием (Polysine Slides, Menzel Gmb H&CoKG, Germany). Депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигеновпроводили при помощи буфера Dewaxand HIER Buffer L (pH 6,0) и Dewaxand HIERBuffer M (pH 8,0) (Thermo, UK) при температуре 95-98 ºС, в течение 20 минут вмодулепредобработки(PT-Module, Thermo, UK).Иммуногистохимическиереакции проводили в автоматизированном режиме с помощью автостейнераThermo Scientific Lab Vision Autostainer 480S (Thermo, UK).
Время инкубации спервичными антителами составило 30 мин. Используемый буфер – рН 8,0.Оценку иммуногистохимической окраски плацентарной ткани проводили втечение следующих двух суток.Разработана шкала оценки экспрессии VEGF-A в плацентарной ткани.Интенсивность цитоплазматической и/или мембранной реакции оценивалиполуколичественно по балльной шкале от 0 до 3+ (табл. 4).Таблица 4. Критерии оценки экспрессии VEGF-A01Менее 25%-+25-50%+++++Более 50%++++++Интенсивность реакции2Доля окрашенныхворсин+65Анализ частоты полиморфизмов гена VEGF-A при плацентарнойнедостаточностиДля выделения материнской ДНК использовалась венозная кровь объемом 5мл, собранная в вакуумные пробирки с ЭДТА в качестве антикоагулянта (1 объемраствора 0,5 М Na2-ЭДТА, pH 8,0 + 9 объемов крови).
После тщательногоперемешивания образцы были помещены в морозильную камеру и хранились при-80оС.Выделение геномной ДНК проводилось за счет связывания ДНК с мембраной(силикой) миницентрифужных колонок набора «QIAamp DNA BloodMiniKit (250)»фирмы QIAGEN и последующей элюции по протоколу «DNA Purification fromBlood or Body Fluids (Spin Protocol)». На первом этапе в 2 мл пробирку (типаEppendorf) вносили 200 мкл размороженной крови, добавляли 20 мкл QIAGENпротеиназы и 200 мкл AL-буфера, перемешивали на вортексе в течение 15 секунд.Полученную смесь инкубировали в течение 10 минут при 56 оС и постоянномперемешивании в термомиксере.
Далее после короткого центрифугирования ккаждомуобразцудобавляли200мкл96%этанола,перемешивалиицентрифугировали. Содержимое пробирки переносили в миницентрифужнуюколонку «QIAamp Mini spin column», помещенную в пустую 2 мл пробирку безкрышки. Колонку центрифугировали в течение минуты со скоростью 6000g, послечего промывали в течение 1 минуты на скорости 6000g последовательно 500 мклрастворов AW1-и AW2- буферов со сменой 2 мл пробирки-сборника ицентрифугированием, после последнего промывания колонка высушиваласьцентрифугированием в течение 3 мин со скоростью 20000g в течение 3 минут.
Дляпроведения элюции колонку помещали в чистую 1,5 мл пробирку с крышкой,непосредственно на мембрану наносили 100 мкл AE-буфера и инкубировали втечение минуты при комнатной температуре, затем центрифугировали в течение 1минуты со скоростью 6000 g.Определение однонуклеотидных полиморфизмов C(-2578)А (rs699947), C(936)T (rs3025039), G(-634)C (rs2010963) гена VEGF-A проводили при помощиметода полимеразной цепной реакции с детекцией в реальном времени,66использовалисьготовыенаборыдляопределенияоднонуклеотидныхполиморфизмов («ДНК-технология», Россия). Подготовка к ПЦР осуществляласьв соответствии с рекомендациями производителя наборов. ПЦР проводилась вдетектирующем термоциклере ДТ-96 («ДНК-технология», Россия) по программе,рекомендованной производителем наборов.
Определение генотипов по окончанииреакции осуществлялось автоматически при помощи программного обеспеченияприбора.Для определения полиморфизма G(-1154)A VEGF-A (rs1570360) былаприменена метод горячего старта ПЦР с использованием следующих праймеров:VEGF_Fw-G:5'-CCCGAGCCGCGTGTGGAG-3'VEGF_Rev-A:5'-GACAGGCGAGCCTCAGCCCT-3'VEGF_ UpPr:5'-GCGGGCGCGTGTCTCTGGAC-3'VEGF_ DwnPr:5'-CTAACCGCTGCGCCTCCCGACAG-3'Для подготовки нижней смеси ПЦР-реакции использовали по 10 пкмольпраймеров VEGF_UpPr и VEGF_DwnP, 5 пкмоль VEGF_Fw-Gи VEGF_Rev-A, 5пмоль dNTP в конечной концентрации 200 мкМ каждого и 4,5 мклдеионизированной воды, смесь отделялась каплей воска. Сверху наслаивалиготовую ПЦР-смесь MixRed («АмплиСенс», Россия) в объеме 10 мкл и добавляли1 мкл раствора геномной ДНК.Амплификацию проводили в термоциклере Eppendorf Master cycler(«EppendorfAG», Германия).
Температурный профиль реакции включал в себяденатурацию (95°С, 3 мин.), 35 циклов амплификации (денатурация (95°С, 30 с),отжиг праймеров (70°С, 10 с), элонгация (72°С, 15 с)).Продукты амплификации визуализировали методом электрофореза в 2%агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия, время фореза - 40 мин,напряжение 6 В/см. В результате амплификации получались следующие продукты:контрольный, размером 357 п.о., полученный во всех реакциях, и продукт длиной220п.о.,соответствовавшийG-аллели,соответствовавший А-аллели (Рис. 4).илипродуктдлиной174п.о.,67700500400300200150100A/AG/GG/GG/AРис.
4. Детекция полиморфизма G(-1154)Aгена VEGFAметодом аллельспецифичной полимеразной цепной реакции.Статистическая обработка данныхСтатистическая обработка данных проводилась при помощи пакетапрограмм STATISTICA 10. Для представления количественных признаков,имеющих нормальное распределение, использовали среднее значение признака истандартное отклонение. Для количественных признаков, значение которых былираспределены непараметрически, рассчитывались медиана и интерквартильныйинтервал. Нормальность распределения признака оценивалась с помощьюкритерия Шапиро-Уилка.Для попарного сравнения групп по количественному признаку использовалсякритерийМанна-Уитни.Определениезначимостивзаимосвязимеждуноминативными переменными проводилось с помощью метода χ2 Пирсона иточного критерия Фишера, а также коэффициента корреляции Спирмена. В случаестатистически значимых различий рассчитывалось отношение шансов при 95%доверительном интервале.
Различия между группами считались статистическидостоверными при p≤ 0,05.Обработка данных также проводилась при помощи веб-программы SNP Stats,разработанной для анализа генетических эпидемиологических исследованийгенетического полиморфизма генов. С помощью данной программы для каждоговыбранного полиморфизма получены частота аллелей и генотипов, тест на68распределение по закону Харди-Вайнберга, анализ ассоциации с необходимымипоказателями на основе линейной или логистической регрессии, для всехполиморфизмов:вычислениенеравновесногосцепления,оценкачастотыгаплотипов, анализ ассоциации гаплотипов с ответом.
Информационный критерийАкаикеиспользовалисоответствующейдляопределенияполученныммоделирезультатамнаследования,(кодоминантная,наиболеедоминантная,рецессивная, сверхдоминантная или лог-аддитивная). Предпочтение отдавалосьмоделям с наименьшими значениями критерия Акаике, указывающими на хорошеесоответствие данным при использовании меньшего числа параметров.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
