Диссертация (1174291), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Результаты оценки антиадгезивной активности вытяжек в отношениирезистентного к гентамицину клинического штамма S. epidermidis на моделикультуры клеток фибробластовОпыты проводили с экспозицией 2 часа в отношении резистентного кгентамицину клинического штамма S. epidermidis 102/18 с нативными (безразведения) контрольной (1) и опытной (6) вытяжками, так как они не оказывалицитотоксического действия на монослой фибробластов. Вытяжки получали насрок 3 месяца с момента формирования образцов костного цемента.
Висследованиях использовали 10% эмбриональную бычью сыворотку в качествебелкового компонента (табл. 3.3).Интенсивность процесса адгезии оценивали по следующим показателям:1) индекс адгезии (ИА) выражали средним числом бактериальных клеток наодной эукариотической клетке; 2) процент пораженных клеток монослоя (ПК%);3) обсемененность 100 клеток монослоя – микробную нагрузку (МН) –определяли по формуле МН= ИА • ПК%.68Таблица 3.3Адгезивная активность клинического штамма Staphylococcus epidermidis 102/18в присутствии вытяжек из костного цементаПоказатели интенсивности процесса адгезии S. epidermidis102/18 (экспозиция 2 часа), n=5Тест-объектИА% ПКМН% адгезии% подавленияотадгезии тест-контроляштаммаКонтроль адгезии тест-штамма к фибробластам:фибробласты +S. epidermidis21,1±3,284,71787,2100-Опыт 1: адгезия тест-штамма в присутствии сыворотки:фибробласты +S.
epidermidis +12,0±3,160,3723,640,459,6741,041,558,510% сывороткаОпыт 2 с контрольной вытяжкой (1)*:фибробласты +S. epidermidis +контрольная13,0±3,157,0вытяжка (1) + 10%сывороткаОпыт 3 с вытяжкой из разработанной антимикробной композиции (6)*:фибробласты +S. epidermidis +опытная вытяжка4,6±1,246,7214,812,088,0(6) + 10%сывороткаПримечание. * – полученные данные имели достоверные отличия от контрольныхзначений (Р<0,01).69Из данных таблицы 3.3.
видно, что процент адгезии тест-штаммастафилококка через 2 часа статистически значимо снизился относительноконтроля в присутствии 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Уровень адгезиистафилококка в присутствии вытяжки из контрольного цемента (1) и 10%эмбриональной бычьей сыворотки находился на уровне адгезии микроба вприсутствиичистойсыворотки,чтосвидетельствуетособственнойантиадгезивной активности сыворотки и об отсутствии такового эффекта увытяжки из костного цемента с гентамицином.В опыте при совместном инкубировании вытяжки из разработаннойантимикробной композиции (6) и 10% сыворотки процент подавления адгезиитест-штамма микроорганизма составил 88%, что статистически значимо нижеконтрольных значений и показателя адгезии микроба в присутствии чистойсыворотки (P<0,05).
Результаты оценки антиадгезивной активности тестируемыхвытяжек представлены на рисунках 3.5 – 3.8.Рис. 3.5. Адгезия резистентного к гентамицину клинического штамма S.epidermidis к фибробластам. Окраска по Романовскому-Гимзе, х650Рисунок3.5демонстрируетвыраженнуюадгезиютест-штаммастафилококка к культуре фибробластов кожи человека в течение 2 часов,сохранение монослоя клеток, но с нарушением его конфлюэнтности иморфологическогосостоянияфибробластов(изменениеформыклеток,70разрушение цитоплазматической мембраны), что свидетельствует о наличиицитотоксического действия микроорганизма.Рис.
3.6. Адгезия резистентного к гентамицину клинического штаммаStaphylococcus epidermidis к фибробластам в присутствии 10% бычьей сыворотки.Окраска по Романовскому-Гимзе, х650Рисунок 3.6 свидетельствует о снижении уровня микробной адгезии ккультуре фибробластов кожи человека в присутствии 10% бычьей сыворотки,сохранение монослоя и морфологии эукариотических клеток.Рис.
3.7. Адгезия резистентного к гентамицину клинического штаммаStaphylococcus epidermidis к фибробластам в присутствии 10% бычьей сывороткии вытяжки (1) из контрольного цемента. Окраска по Романовскому-Гимзе, х40071Рисунок 3.7 свидетельствует о том, что уровень адгезии стафилококка вприсутствии вытяжки из контрольного цемента (1) и 10% эмбриональной бычьейсыворотки находился на уровне действия чистой сыворотки, что свидетельствуетоб отсутствии антиадгезивного эффекта вытяжки из костного цемента сгентамицином.Рис. 3.8. Адгезия резистентного к гентамицину клинического штаммаStaphylococcus epidermidis к фибробластам в присутствии вытяжки изразработанной композиции (6).
Окраска по Романовскому-Гимзе, х400Рисунок 3.8 демонстрирует отсутствие адгезии тест-штамма стафилококка ккультуре фибробластов кожи человека в течение 2 часов, сохранение монослояклеток и морфологического состояния фибробластов, что свидетельствует и оботсутствии цитотоксического действия микроорганизма в присутствии вытяжкииз разработанной композиции (6).3.5. Результаты оценки in vitro скорости формирования микробной биопленкина спейсере для изучения влияния применяемой антимикробной композициина поведение инфекта в ранеВ течение 3 недель еженедельно оценивали скорость формированиямикробной биопленки клинического штамма S. epidermidis 102/18 в контроле72(спейсер из костного цемента с гентамицином) и в опыте (спейсер из костногоцемента с гентамицином, 1% повиарголом, 1% диоксидином, 1% ПВП) поколичеству КОЕ/см2 и белка в питательной среде (методом титрования споследующим высевом на плотные питательные среды) и на поверхностиспейсера (Lowry O.H.
et al., 1951).В контрольных плоскодонных планшетах (in vitro) наблюдали значительныйрост инфекта в питательной среде после инкубации контрольного спейсера сгентамицином: к концу 1-й недели – до 109 КОЕ/мл; к концу 2-й недели – до 1010КОЕ/мл; к концу 3-й недели – до 1011 КОЕ/мл. В отличие от этого, в опытныхпланшетах со спейсером, содержащим гентамицин, повиаргол, диоксидин и ПВП,не наблюдали роста тест-штамма в питательной среде в течение 3 недель(табл.
3.4).Таблица 3.4Оценка in vitro роста штамма S. epidermidis 102/18 в питательной среде вприсутствии спейсера из костного цементаОбъектисследованияРост штамма S. epidermidis 102/18 впитательной среде со спейсером, КОЕ/млчерез 1 неделю через 2 недели через 3 неделиСпейсер с гентамицином (контроль) 8,8±1,3 × 108 1,8±0,2 × 1010 1,9±0,3 × 1011Спейсер с гентамицином,повиарголом, диоксидином, ПВП000(опыт)1. Исследования проводили методом титрования с последующим высевом на агарМюллера-Хинтона.2. Исходная микробная нагрузка штамма S.
epidermidis 102/18 составила 1х107КОЕ/мл.3. В каждом исследовании (n=5) различия между контролем и опытомстатистически значимы (Р<0,05).Данные таблицы 3.5 демонстрируют значительный прирост микробнойбиомассы в контрольных образцах питательной среды после совместнойинкубации контрольного спейсера из костного цемента с гентамицином синокулятом стафилококка. При оценке оптической плотности питательной средыпосле совместной инкубации спейсера из костного цемента с гентамицином,повиарголом, диоксидином, ПВП и тест-штамма стафилококка получали73значения, статистически значимо не отличающиеся от показателей базовогораствора (Р>0,05).Таблица 3.5Оценка оптической плотности питательной среды после совместной инкубацииспейсеров с S.
epidermidis 102/18 (in vitro)Значение оптической плотности (OD),измерение при λ=750 нмОбъект исследованиячерез 1 неделю через 2 недели через 3 неделиБазовый раствор(смесь реактивов для0,001±0,00020,001±0,00010,001±0,00011,79±0,211,92±0,313,79±0,240,001±0,00010,002±0,00010,001±0,0002калибровки прибора)Спейсер с гентамицином(контроль)Спейсер с гентамицином,повиарголом, диоксидином,ПВП (опыт)Примечания:1.Исследования проводили методом оценки количества белка по Лоури(Lowry O.H. et al., 1951).2.Исходная микробная нагрузка штамма S. epidermidis 102/18 составила 1х107КОЕ/мл.3.В каждом исследовании (n=5) различия между контролем и опытомстатистически значимы (Р<0,05).Данные таблицы 3.6 демонстрируют увеличение популяции стафилококкаэпидермального на поверхности контрольного спейсера из костного цемента сгентамицином, при этом на опытных образцах спейсера из костного цемента с74гентамицином, повиарголом, диоксидином и ПВП не наблюдали ростамикроорганизма.Таблица 3.6Оценка in vitro роста штамма S.
epidermidis 102/18 на поверхности спейсера изкостного цементаРост штамма S. epidermidis 102/18 вОбъектгомогенизате микробной биопленки сисследованияповерхности спейсера, КОЕ/см2через 1 неделю через 2 недели через 3 неделиСпейсер с гентамицином(контроль)5,9±1,3 × 1081,6±0,2 × 10102,9±0,6 × 1011000Спейсер с гентамицином,повиарголом, диоксидином,ПВП (опыт)Примечание:1. Исследования проводили методом титрования с последующим высевом наагар Мюллера-Хинтона.2. Исходная микробная нагрузка штамма S. epidermidis 102/18 составила 1х107КОЕ/мл.3. В каждом исследовании (n=5) различия между контролем и опытомстатистически значимы (Р<0,05).В контрольных образцах количество белка (по Лоури) на поверхностиспейсера из костного цемента с гентамицином (in vitro) возрастало по меренарастания матрикса микробной биопленки в отличие от опытного спейсера(табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
