Диссертация (1174291), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Вытяжки из образцов композицийполучалистандартнымРуководящихметодомметодическихсогласноматериалахтребованиям,поизложеннымвтоксиколого-гигиеническимисследованиям полимерных материалов и изделий на их основе медицинскогоназначения МЗ СССР (1987). Вытяжки готовили из цементных полусфер,выдерживая их 24 часа в термостате в стерильном фосфатном буфере (рН 7,2–7,4)при температуре 37°С.
Вытяжки для исследований отбирали через определенныеэкспозиции, при этом каждый раз соответствующую цементную смесьпереносили в новую стерильную емкость с фосфатным буфером.3.2. Результаты оценки токсичности вытяжек in vitro и in vivoВ связи с включением в костный цемент с гентамицином антисептиковповиаргола, диоксидина и полимера ПВП была поставлена задача оценитьбезопасность полученных композиций в опытах in vivo и in vitro. Многиеисследователисвязываютнеудовлетворительныеисходыцементногопротезирования с техническими ошибками.
Существует мнение, что применениекостного цемента может провоцировать развитие некроза тканей и аллергическихреакций, оказывать стимулирующее влияние на процессы костной резорбциивследствие действия продуктов полимеризации, способствуя расшатываниюэндопротеза.Критериями безопасности были выбраны: общетоксическое, раздражающеекожу и слизистые оболочки и сенсибилизирующее действие (in vivo), а такжеморфологическая оценка состояния монослоя клеток фибробластов человека вкультуре (in vitro). Результаты оценки цитотоксического действия in vitro вытяжекиз композиций костного цемента на культуру клеток фибробластов кожи человекапредставлены в таблице 3.1.
Исследования проводили с 10% эмбриональнойбычьей сывороткой.57Таблица 3.1Оценка цитотоксического действия вытяжек из композиций костного цементаТестируемыеобъектыИнтактныймонослойфибробластов вкультуре 48 чКонтрольотсутствия ЦТД –0,9% растворнатрия хлорида10%эмбриональнаябычья сывороткаВытяжка 1(КЦ + Gent)+ 10% сывороткаВытяжка 2(КЦ + Gent +Van)+ 10% сывороткаВытяжка 3(КЦ + Gent + 1%Ag)+ 10% сывороткаВытяжка 4(КЦ + Gent + 1%Dxd)+ 10% сывороткаВытяжка 5(КЦ + Gent + 1%Ag + 1% Dxd)+ 10% сывороткаВытяжка 6(КЦ + Gent + 1%Ag + 1% Dxd +1% ПВП)+ 10% сывороткаРеакция фибробластов в культуре на воздействие препаратовСтепень ЦТДРеакция клеток монослоя24 ч3 мес24 ч3 мес--НормальныймонослойНормальныймонослой00Отсутствие ЦТД,нормальныймонослойОтсутствие ЦТД,нормальныймонослой0000Отсутствие ЦТД,нормальныймонослойОтсутствие ЦТД,нормальныймонослойОтсутствие ЦТД,нормальныймонослойОтсутствие ЦТД,нормальныймонослой0Отсутствие ЦТД,нормальныймонослойОтсутствие ЦТД,нормальныймонослой0Отсутствие ЦТД,нормальныймонослойОтсутствие ЦТД,нормальныймонослой0Отсутствие ЦТД,нормальныймонослойОтсутствие ЦТД,нормальныймонослой00Отсутствие ЦТД,нормальныймонослойОтсутствие ЦТД,нормальныймонослой00Отсутствие ЦТД,нормальныймонослойОтсутствие ЦТД,нормальныймонослой000Примечание: КЦ – костный цемент; Gent – гентамицин; Van – ванкомицин;Ag–повиаргол;поливинилпирролидон.Dxd–диоксидин;ПВП–высокомолекулярный58Данные таблицы 3.1 показывают, что все исследуемые вытяжки (1–6) через24 часа и через 3 месяца не оказывали повреждающего действия на монослойклеток фибробластов кожи человека, в каждом случае степень ЦТД составила 0баллов.
На каждом сроке наблюдали целый монослой фибробластов, все клетки иядра сохраняли свою форму и целостность. Это связано с тем, что содержаниеактивных компонентов в вытяжке значительно меньше вводимых в костныйцемент БАВ (антибиотиков, антисептиков и ПВП). Результаты контроля монослояфибробластов кожи эмбриона человека и оценки цитотоксического эффектавытяжки (6) из антимикробной композиции с 1% повиарголом, 1% диоксидином и1% ПВП представлены на рисунках 3.1 и 3.2.Рис. 3.1.
Контроль конфлюэнтного монослоя клеток фибробластов кожи эмбрионачеловека. Окраска по Романовскому-Гимзе, х400Рис. 3.2. Состояние монослоя клеток фибробластов кожи эмбриона человекапосле воздействия опытной вытяжки (6) с 1% повиарголом, 1% диоксидином и1% ПВП через 3 месяца. Окраска по Романовскому-Гимзе, х40059Кроме того, отсутствие цитотоксического действия вытяжки из опытнойантимикробной композиции на основе костного цемента с гентамицином иантисептиками связано с присутствием в ней полимера ПВП, обладающегособственной сорбционной и антитоксической активностью (Бюлер Ф., 2003).При изучении безопасности вытяжек из образцов костного цемента in vivo налабораторных животных показано, что при введении каждой из 6 вытяжек вжелудок мышей гибели животных не отмечено в течение срока наблюдения (3дня). Таким образом, в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 тестируемые вытяжкисоответствуют классу 4 малоопасных веществ при введении в желудок, иконцентрации действующих веществ составляют более 2500 мг/кг.Показано, что трехдневное энтеральное введение исследуемых вытяжек невызывало клинических признаков интоксикации во всех группах животных: ихобщее состояние, поведение, двигательная активность, режим потребления икорма, а также внешний вид шерсти, кожных покровов и слизистых оболочекоставались в пределах физиологической нормы.
После выведения животных изэксперимента на вскрытии: ткани в месте введения, внутренние органы,регионарные лимфатические узлы у опытных мышей в пределах физиологическойнормы и контроля; весовые коэффициенты внутренних органов у опытных мышейне имели статистически значимых отличий от аналогичных показателей вконтроле. При однократном и многократном нанесении тестируемых вытяжек накожу морских свинок не отмечали признаков воспаления и раздражения кожи(суммарно 0 баллов). Таким образом, показано, что вытяжки из всех образцовантимикробного костного цемента по влиянию на кожу можно отнести кчетвертому классу малоопасных веществ.При введении всех вытяжек в конъюнктивальный мешок глаз кроликов вовсех случаях отмечены небольшой отек (0,5 балла) и эритема (0,5 балла).Полученные данные свидетельствуют о том, что тестируемые вытяжки оказываютслабое раздражающее действие на слизистые оболочки глаза и относятся кчетвертому классу опасности.60После выведения животных из эксперимента на вскрытии: ткани в местевведения, внутренние органы, регионарные лимфатические узлы у опытныхмышей в пределах физиологической нормы и контроля, весовые коэффициентывнутренних органов у опытных мышей не имели статистически значимыхотличий от аналогичных показателей в контроле.3.3.
Сравнительный анализ антимикробной активности костного цементаНа базе испытательного лабораторного центра ФБУН НИИ эпидемиологииимикробиологииимениПастерапроанализированырезультатыоценкиантимикробной активности тестируемых вытяжек из образцов костного цемента,которую изучали диско-диффузионным методом. В качестве тест-штаммовтестировали Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 /S/ (чувствительный кгентамицину) и клинический изолят S.
epidermidis 102/18 /R/ (устойчивый кгентамицину, МИК − 30 мкг/мл [МУК 4.2.1890-04]). Микробная нагрузкасоставила 0,5 по стандарту мутности Макфарланда (108 КОЕ/мл). Посевыинкубировали при 37°С в течение 24 часов.Посев вытяжек проводили каждые 3 суток в течение 3 месяцев, а затем –каждые 14 суток в течение 8 месяцев. После очередного высева менялистерильный фосфатный буфер в емкостях с цементом для получения очереднойвытяжки. Полученные величины зон задержки роста чувствительного кгентамицину штамма стафилококка сравнивали с требованиями EUCAST-2018 поуровню чувствительности к гентамицину (зона задержки роста чувствительного кгентамицину тест-штамма коагулазонегативного S.
epidermidis должна быть ≥ 22мм).Приоценкеэффективностидействияантимикробнойкомпозиции,содержащей антисептики, требования EUCAST-2018 не применимы. Мы считаем,что наличие любой зоны задержки роста тест-микроорганизма свидетельствует опроявлении антимикробной активности композиции в отношении него. Однакоэффективные антисептики должны снижать уровень микробной популяции неменее чем на 2 log10 (Kramer A. et al., 2008).61В период эксперимента, когда методом диффузии в агар получали величинызон задержки роста обоих тест-штаммов ниже уровня чувствительности кгентамицинупоEUCAST-2018(< 22мм),дополнительнопроводиликоличественный тест чашечно-суспензионным методом (Афиногенов Г.Е.,Краснова М.В., 2004) с целью подтверждения антимикробного действия вытяжекиз образцов костного цемента с антисептиками и ПВП в отношении любогоизолята S.
epidermidis, микробная нагрузка которых составила 108 КОЕ/мл. Привысеве 0,1 мл инокулята на чашку Петри конечная микробная нагрузка составила107 КОЕ/мл.Результаты сравнительной оценки антимикробной активности вытяжек изразличных образцов костного цемента представлены в таблице 3.2. Из данныхтаблицы видно, что в отношении чувствительного штамма S. epidermidis ATCC14990 антимикробный эффект контрольной вытяжки (1) сохранялся на уровнетребований EUCAST-2018 по уровню чувствительности S.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
