Диссертация (1174291), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Методы исследованияВ работе применялись клинические, лабораторные, лучевые и статистическиеметоды исследования.432.2.1. Клинические методы исследованияПациенты, госпитализированные в отделение гнойной хирургии клиникитравматологии и ортопедии ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И.Мечникова» с диагнозом«глубокая поздняя перипротезная инфекция тазобедренного сустава», проходиликомплексное обследование.Изучаликлиническуюкартинуперипротезнойинфекции,характерсанирующей операции, выбор спейсера, возникшие осложнения и исходылечения.
По показаниям больных консультировали другие специалисты. Приоценке местного статуса обращалось внимание на наличие местных признаковвоспаления, измеряли амплитуду движений в обоих тазобедренных суставах.Большинство пациентов предъявляли жалобы на постоянные или периодическиеболи и ограничение движений в пораженном суставе.2.2.2. Лабораторные методы исследованияВсембольнымвыполняликлиническийанализкрови,развернутыйбиохимический анализ крови, коагулограмму, общий анализ мочи, ЭКГ,фиброгастроскопию и УЗИ сосудов нижних конечностей.Особое значение придавалось изменениям показателей лейкоцитарнойформулы,гемоглобина,эритроцитов(СОЭ),С-реактивноголейкоцитарногобелка(СРБ),индексаскоростиинтоксикацииоседания(ЛИИ),прокальцитонина (ПКТ). Лабораторные показатели крови и мочи исследовалисьдо операции и в постоперационном периоде, а при повышении показателейвоспалительных маркеров (лейкоциты, СОЭ, СРБ) – через 2–3 дня дляопределения динамики инфекционного процесса.При появлении признаков воспаления в области операционной ранывыполнялась пункция надфасциально, подфасциально и полости сустава длямикробиологического исследования для определения роста микрофлоры иопределения чувствительности к антибиотикам.44Весь исследуемый материал пунктатов отправлялся в бактериологическуюлабораториюСЗГМУпитательныесредыим.(средаИ.И.Мечникова,контролягдепроводилисьстерильности,5%посевыкровянойнаагар,сывороточный агар).
При отсутствии роста микроорганизмов и нормальныхпоказателях лабораторных исследований производился второй этап лечения –удалениеспейсераиустановкаэндопротезатазобедренногосустава.Интраоперационно во время санирующей операции брали для посева содержимоераны, компоненты спейсера при повторных санирующих операциях и 3–5тканевых биоптатов из разных областей операционной раны. Аспират и тканевыебиоптаты в операционной переносились в пробирки с питательными средами, акомпоненты спейсеров – в пластиковый контейнер с водным растворомхлоргексидина, после чего отправлялись в лабораторию для микробиологическогоисследования. Всем пациентам выполняли бактериологическое исследованиежидкостей и тканей с определением чувствительности к антибиотикам.2.2.3. Микробиологические методы исследованияМикробиологический метод обследования является обязательным приглубокой перипротезной инфекции ТБС с целью определения вида микрофлоры ипоследующего подбора адекватной антибиотикотерапии. Для этого осуществлялипосев из свищевых ходов, а при их отсутствии производили пункциютазобедренного сустава, а также интраоперационно – непосредственно из 3-5участков раны.
Микробиологические посевы и определение чувствительностивыделенныхизолятовкантибиотикамиантисептикампроводиливбактериологической лаборатории СЗГМУ им. И.И. Мечникова.Посевы исследуемого биоматериала пунктатов проводили на питательныесреды (среда контроля стерильности, 5% кровяной агар, сывороточный агар),термостатировали при 37°С. Период контроля роста микрофлоры составил от 24часов до 14 дней. Во всех случаях роста микрофлоры выполняли окраскуполученного материала по Граму.45Приотсутствииростамикроорганизмовинормальныхпоказателяхлабораторных исследований проводили второй этап лечения с удалением спейсераи установкой эндопротеза тазобедренного сустава.
Интраоперационно, во времядебридмента, повторно брали для посева содержимое раны, компоненты спейсераи 5 тканевых биоптатов из разных областей операционной раны. Аспират,тканевые биоптаты, компоненты спейсера переносили в стерильные пробирки иликонтейнеры с питательными средами, после чего отправляли в лабораторию длядальнейшего микробиологического исследования.Всем пациентам выполняли бактериологическое исследование жидкостей итканей с определением чувствительности к антибиотикам и антисептикам. Взятиебиологического материала из ран и количественное определение микробиотыосуществляли согласно методическим рекомендациям «Лабораторный контрольпротивоэпидемического режима стационаров и методика бактериологическихисследований при возникновении гнойно-септических инфекций» (Л., 1985).Выделение и идентификацию возбудителей проводили в соответствии с ПриказомМЗ СССР № 535 от 22.04.85г.
и Приказом МЗ РФ № 8 от 1995 г.Все работы с микроорганизмами и с культурой клеток фибробластовпроводили в ламинарных шкафах II класса фирмы JOUAN (Франция).Определение видового состава клинических изолятов раневой микробиотыпроводили с использованием автомата iEMSReader-MF (ThermoLabsystems,Финляндия), программ «Микроб-Автомат» и «Микроб-2»© МедПроект-3, методаMULDI-TOF масс-спектрометрии. Определение уровня устойчивости выделенныхизолятов к анибиотикам проводили на микробиологическом автоматическоманализаторе VITEK-2 (Bio-Merieux, Франция).
Культуры микроорганизмовхраниливстандартныхпробиркахMicrobankтмспитательнойсредой(PROLABDiagnostics, Канада) в холодильнике при –70°С.Анализ полученных вытяжек из образцов костного цемента проводили вИЛЦФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера. Опыты in vitroпроводили на двух клинических тест-штаммах Staphylococcus epidermidis,чувствительном (МИК ≤ 4 мкг/мл) и резистентном (МИК = 310 мкг/мл) к46гентамицину.
Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) гентамицинаопределяли методом двукратных серийных разведений (качественный тет) вбульоне Мюллера-Хинтона. В чашечно-суспензионном методе использовали 5%кровяной агар. В тестах по оценке антимикробной активности антисептиков вприсутствии естественных нейтрализаторов использовали эмбриональную бычьюсыворотку (ООО «БИОЛОТ», Россия).Инактивациюостаточныхколичествантисептиковпроводилисиспользованием универсального нейтрализатора следующего состава: твин-803%, сапонин 3%, гистидин 0,1%, цистеин 0,1%.
Исследования с анаэробамипроводили в анаэростатах с использованием газ-паков фирмы «BectonDickinson»(США).Вмикробиологических,гистологических,патоморфологическихисследованиях использовали стандартный набор необходимых реактивов.2.2.4. Изучение чувствительности микроорганизмовОпределение зон ингибирования роста (диско-диффузионный метод)Методоснованнадиффузиивеществаизносителя(диска)винокулированную плотную питательную среду.
Для решения поставленных задачиспользовали стандартные питательную среду Мюллер-Хинтон (ООО «НИЦФ»,Россия) и диски с антибиотиками (Bio-Rad Laboratories, GmbH, Германия; BioMerieux, Франция). Ненагруженные стандартные (диаметр 6 мм) картонные дискипропитывали10мклантисептикавсоответствующейконцентрации.Пропитанные диски высушивали в термостате и использовали в соответствии спринятойметодикой(Методическиерекомендациипоопределениючувствительности микроорганизмов методом диффузии в агар с использованиемдисков. М., 1985). Результаты оценивали по наличию зоны подавления ростатест-микроорганизма. При анализе дисков с антисептиками тест-микроорганизмопределяли как чувствительный при наличии зоны ингибирования любогодиаметра.
При отсутствии такой зоны культуру считали устойчивой кантисептику в данной концентрации. При анализе дисков с антибиотиками47(гентамицин) тест-микроорганизм определяли как чувствительный при наличиизоны ингибирования не менее 18 мм (EUCAST-2018).Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) препаратовМИК антибиотика и антисептиков определяли, используя метод двукратныхсерийных разведений в жидкой среде.
Значение МИК определяли какминимальную концентрацию химического агента, которая ингибировала росттест-микроорганизма после 24 часов инкубации в оптимальных условиях.При данной дозе препарата содержимое пробирки с инокулятом былопрозрачным с отсутствием видимого роста.Чашечно-суспензионный методПараллельно оценку чувствительности тест-штаммов к антисептикам иливытяжкам проводили чашечно-суспензионным методом, в котором оценивалиуровень снижения микробной популяции в десятичных логарифмах.Метод отличается от существующих пробирочных методов тем, что вкачестве резервуаров для взаимодействия микробной суспензии и исследуемоговещества используют цилиндры из инертного материала, помещенные на плотнуюпитательную среду, содержащую органический субстрат (например, кровь) вчашках Петри, и комплексного нейтрализатора, добавляемого к миксту поокончании необходимой экспозиции.
Через время тестируемой экспозицииудаляют цилиндры и распределяют микст по поверхности плотной питательнойсреды. Эффективность исследуемого вещества оценивают по коэффициентуредукции (Кред).Культура клеток фибробластов эмбриона человекаИсследования по оценке токсичности и антиадгезивной активностивыполняли на диплоидных клетках эмбриона человека – легочных и кожномышечных фибробластах.
Клеточные культуры являются линиями из коллекцииклеточных культур ФГБУ «Научно-исследовательского института гриппа имениА.А.Смородинцева»МинздраваРоссии(Санкт-Петербург),иони48охарактеризованывсоответствиистребованиями,предъявляемымикпаспортизации депонированных линий.Дляоценкииспользованиемостройтоксичностипредлагаемойвытяжекантимикробнойизкостногокомпозициицементасформировалимонослой фибробластов в 96-луночных планшетах (Sarstedt, Германия) в ротовойпитательной среде Игла в течение 48 часов при 37°С.Для оценки антиадгезивной активности вытяжек из костного цемента сиспользованиемпредлагаемойантимикробнойкомпозицииформированиеконфлюэнтного монослоя фибробластов осуществляли на покровных стеклах впробирках Лейтона в среде ростовой питательной Игла или на накладках TissueCulture Coverslips 13 мм (Германия) в ростовой питательной среде RPMI в течение48 часов при 37°С.Морфологическая оценка состояния монослоя фибробластов при изучениицитотоксического действия вытяжек из костного цемента с использованиемпредлагаемой антимикробной композицииДля оценки цитотоксического действия тестируемых вытяжек проводилисовместную инкубацию фибробластов с растворами тестируемых средств в 96луночных планшетах (от 3 до 5 лунок на каждый препарат) в питательной средеИгла при 37°С в течение 2 часов.
Затем клетки монослоя отмывали от растворапрепарата многократной сменой среды Игла, фиксировали 96º этиловым спиртом,окрашивали по Романовскому-Гимзе и иследовали под микроскопом. Для оценкиострого цитотоксического действия (ЦТД) использовали 5-балльную шкалу FDA(США): 0 баллов – отсутствие цитотоксического действия, 1 балл – слабоетоксическое действие (20–25% лизированных клеток), 2 балла – мягкоетоксическое действие (50% гибели клеток), 3 балла – умеренное токсическоедействие (70–75% клеточного монослоя содержат округлые и/или лизированныеклетки), 4 балла – тяжелое токсическое действие (100% деструкция клеточногомонослоя). В каждом опте оценивали не менее 100 клеток.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
