Диссертация (1174225), страница 38
Текст из файла (страница 38)
По длинному протоколу ЭКО с 21-го дня мен-206струального цикла (с середины лютеиновой фазы) назначались ежедневные инъекции в дозе 0.5 мг. Начиная со 2-3 дня наступившей менструации, к терапии добавляли инъекции гонадотропинов в суточной дозе 225-450 МЕ. Дозы вводимыхгонадотропинов подбирались индивидуально в зависимости от возраста пациентки, показателей овариального резерва и эффективности предыдущих попытокЭКО.
После визуализации при ультразвуковом исследовании не менее 2 фолликулов диаметром более 18 мм вводили 10 000 ЕД рекомбинантного ХГЧ, а через 36часов проводили трансвагинальную пункцию фолликулов яичника. В короткомпротоколе ЭКО препараты рекомбинатного ФСГ вводили со 2-3 дня менструального цикла, по достижению доминантным фолликулом диаметра 14 мм к терапиидобавляли ант-ГнРГ.
При экстракорпоральном оплодотворении в естественномцикле гормональная стимуляция не проводилась. Введение ХГЧ и пункция фолликулов в коротких протоколах и в естественном цикле проводились аналогичнодлинному протоколу.Трансвагинальная пункция 1-2 яйцеклеток осуществлялась без примененияанестезии. Получение большего количества ооцитов проводилось с использованием внутривенного анестетика - пропофола или ингаляционного анестетика – севофлурана.Пропофол(2,6–диизопропилфенол),представляетсобойэффективный внутривенный анестетик, который замедляет закрытие канала вГАМК-рецепторе, потенциируя гамма-аминомасляную кислоту (ГАМК), котораяявляется важнейшим тормозным медиатором в центральной нервной системе.Севофлуран((1,1,1,3,3,3–гексафтор-2-(фторметокси)-пропил))яаляетсясредством для ингаляционного наркоза, его механизм действия заключается вусилении активности ингибирующих постсинаптических каналов (ГАМК иглицин) и ингибировании активности возбуждающих синаптических каналов (Nметил-D-аспартат (NMDA), никотиновый ацетилхолин, серотонин и глутамат) вЦНС.При оценке эмбрионов на 3 сутки использовали численно-буквеннуюклассификацию, при этом выделяли эмбрионы «хорошего» качества (А),«среднего» качества (В) и «плохого» качества (С).
Эмбрионы переходного207качества, у которых невозможно точно определить степень фрагментации,обозначались как AB, BC, CB и т.д. На 5-е сутки культивирования оценка степенизрелостибластоцистпроводиласьнаосновеихразмера,состояниявнутриклеточной массы и степени зрелости трофобласта. Бластоцисты хорошегокачества считались размером 3–5, с плотной упаковкой внутриклеточной массой исодержащих однослойный трофобласт.Для оценки уровня окислительного стресса в фолликуле, использовалиметодику кинетической хемилюминесценции [69]. Фолликулярную жидкость,полученную из доминантного фолликула помещали в вакуумные пробирки сгепарином лития и хранили при температуре –20 ⁰ С.
Для проведенияисследований фолликулярная жидкость размораживалась в условиях комнатнойтемпературы. В основе используемой методики лежит хемилюминесцентнаяреакция между люминолом (5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-фталазиндионом),который является активатором хемилюминесценции, и диазосоединением 2,2 ’азо-бис(2-аминодинпропаном) дигидрохлоридом (АБАП), который разлагаетсяпри нагревании на два свободных радикала (2R•).
При наличии молекулярногокислорода (O2) этот радикал становится пероксильным радикалом (ROO•), который затем окисляет хемилюминесцентный зонд люминол (LH2) и превращается врадикал люминола (LH•). Описанные выше реакции схематично представленыниже:АБАП → 2R• (1)R• + O2 → ROO• (2)ROO• + LH2 → ROOH + LH• (3).После этого образовавшийся радикал люминола испускает квант света,количествокоторогорегистрируетсяспомощьюодноканальногохемилюминометра (Lum-5773, «ДИСофт», Россия). Без использования активаторахемилюминесценции (люминола) уровень свечения будет крайне низким инеобходимобудетбиологическихиспользоватьжидкостей.ВоченьсвязисбольшоеэтимколичествомыизучаемыхиспользовалисмесьАБАП+люминол, которая инициировала образование свободных радикалов всистеме.
Как только регистрируемое свечение достигало стационарного уровня(I0) в микропробирку добавляли фолликулярную жидкость и регистрировали208затуханиеинтенсивностисвечениявследствиедействияантиоксидантовфолликулярной жидкости. Далее вновь на кинетической кривой наблюдалинарастания интенсивности хемилюминесценции(I). Для визуализации иобработкипрограммноеPowerGraphполученных3.3.Типичнаяданныхкриваяиспользовалихемилюминесценцииприобеспечениеисследованииантиоксидантных свойств фолликулярной жидкости фолликулярной жидкостипредставлена на Рис. 5.1.На хемилюминограмме антиоксидантного профиля фолликулярной жидкости оценивались два параметра: площадь подавления свечения S, отражающеедействие сильных антиоксидантов фолликулярной жидкости мочевой кислоты иаскорбата, и прирост стационарного уровня, вызванный прооксидантной активностью альбумина за счет реакций единственной тиоловой группы.
Параметр ∆I характеризовал уровень окислительной модификации альбумина: чем сильнее быловыражено окисление альбумина, тем меньшим было значение ΔI.Рис.5.1.Типичнаякриваяхемилюминесценцииприисследованииантиоксидантных свойств фолликулярной жидкости. I0 – начальный уровеньстационарного свечения (до внесения исследуемого образца фолликулярнойжидкости); S– площадь подавляемогосвечениязасчет действияантиоксидантов; I – уровень стационарного свечения после израсходованияантиоксидантов образца; ΔI = I – I0 – разность между уровнем свечения послевнесения образца и начального уровня стационарного свечения.209Регистрация оценки активности источников АФКферментов(прооксидантногопрофиля)осуществлялась— оксидантныхна12-канальномхемилюминометре (Lum-1220, «ДиСофт», Россия).
В начале эксперимента регистрировали спонтанную хемилюминесценцию фолликулярной жидкости в течение нескольких минут. Далее в качестве хемилюминесцентного зонда на супероксидный радикал использовался люцигенин. Спустя 5–7 минут добавляли НАДН,выступающеговроливосстановительногоэквивалентапрооксидантныхферментов. Восстановление люцигенина осуществлялось при участии следующихферментов: ксантиноксидаза, NO-синтаза, липоамиддегидрогеназа, глюкозооксидаза, альдегидоксидаза.
По сути, параметр IOx отражает суммарную стимулированную активность прооксидантных ферментов. Для визуализации и обработкиполученных данных использовали программное обеспечение PowerGraph 3.3.Типичная кривая хемилюминесценции при исследовании прооксидантныхсвойств фолликулярной жидкости представлена на Рис. 5.2.Рис. 5.2. Типичная кривая хемилюминесценции при исследовании прооксидантныхсвойств фолликулярной жидкости. Iсп – спонтанная хемилюминесценцияфолликулярной жидкости; Iлюц – хемилюминесценция после внесения ХЛ-зонда(люцигенина); IOx – хемилюминесценция после внесения НАДН (активностьпрооксидантных ферментов).На кинетических кривых, характеризующих активность прооксидантныхферментов фолликулярной жидкости, измеряли параметрIOx: при этом210учитывали, что чем активнее действие ксантиноксидазы, тем выше было значениеIOx.Статистическая обработка данных проводилась с помощью методов параметрической и непараметрической статистики.
Проверка нормальности распределения осуществлялась по критерию Шапиро-Уилка. Для статистически значимогоопределения достоверности различий в двух независимых выборках использовался U-тест Манн-Уитни. Для оценки различий качественных признаков рассчитывался критерий хи-квадрат. При малых объемах выборок пациенток вычислялсяточный критерий Фишера. Все вычисления проводились в программе MedCalc.Клиническая характеристика пациенток, включенных в первый этап исследования (Табл. 5.3)Средний возраст пациенток с НГЭ (n=50) составил 37,6 ± 0,5 лет, из нихпервичное бесплодие было диагностировано у 18 обследованных, вторичное бесплодие — у 32.
При анализе акушерского анамнеза было установлено, что средипациенток, страдающих эндометриоз-ассоциированным бесплодием у 18 пациенток беременность отсутствовала, у 14 наблюдаемых отмечены роды через естественные родовые пути, либо путем операции кесарева сечения, у 4 пациентокбыли аборты в анамнезе. Длительность бесплодия варьировала от 1 до 8 лет, приэтом срок инфертильности менее 3 лет был у 18 пациенток, более 3 лет у 31наблюдаемой.
Анализ гинекологического анамнеза вновь показал неоправданнозавышенную частоту воспалительных заболевания половых путей, которая выявлялась у 15 пациенток, кроме того из гинекологических заболеваний выявляласьмиома матки у 9 больных, фоновые заболевания шейки матки у 3 обследованных,гиперпластические процессы эндометрия у 2 пациенток, у 18 пациенток отсутствуют указания на перенесенные гинекологические заболевания. Распространенность эндометриоза, оцененная по классификации американского общества фертильности (1996г.), соответствовала I–II стадии у 24 пациенток, III–IV стадии – у26.
Во время ранее перенесенных оперативных вмешательств 18 пациенткам выполнялась резекция яичников по поводу одно- или двусторонних эндометриоид-211ных кист, у 9 женщин была произведена тубэктомия в связи с выраженным вследствие эндометриоза спаечным процессом в малом тазу с вовлечением маточныхтруб. Снижение показателей овариального резерва на основании уменьшенияуровня АМГ менее 1,0 нг/мл выявлялось у 10 пациенток, повышения уровня ФСГболее 10 МЕ/л у 15 наблюдаемых, определения числа антральных фолликуловменее 5 у 29 пациенток.
При этом средний уровень АМГ составил 2,98 ± 1,86нг/мл и ФСГ 8 ± 3,6 МЕ/мл. Первая попытка ЭКО была проведена 31 пациентке, уостальных данная попытка была повторной.Табл. 5.3. Клиническая характеристика пациенток, включенных в первый этаписследованияПараметрВозраст, летКоличество пациенток с первичным бесплодиемКоличество пациенток с родамив анамнезеУровень АМГ, нг/млУровень ФСГ, МЕ/млКоличество пациенток с первойпредстоящей попыткой ЭКОНГЭ (n=50)37,6 ± 0,518 (36,0%)ТПБ (n=52)37,8 ± 1,220 (38,5%)рp>0,05p>0,0514 (28,0%)14 (26,9%)p>0,052,98 ± 1,868 ± 3,631 (62,0%)2,63 ± 2,797,5± 2,935 (67,3%)p>0,05p>0,05p>0,05Средний возраст пациенток с ТПБ (n=52) составил 37,8 ± 1,2 года.
Из нихпервичное бесплодие было выявлено у 20 женщин, вторичное бесплодие - у 32.Длительность бесплодия менее 3 лет была зарегистрирована у 17 пациенток, уостальных женщин неэффективные попытки зачатия были в течение 3 и болеелет. Из 32 пациенток, имевших в анамнезе беременность: самопроизвольные илиоперативные роды были отмечены у 14 пациенток, внематочная беременностьбыла у 24 пациенток, искусственный аборт по желанию пациентки был произведен в 12 наблюдениях, самопроизвольное прерывание беременности было у 3 обследованных.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
