Диссертация (1174209), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Кроме того проводилось эпидемиологическое анкетирование (анкета,разработанная международной рабочей группой по изучению эпидемиологии РСв мире Норвежской Академии наук и письменности, переведенная и дополненнаяна кафедре неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики ФГБОУ ВОРНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) (приложение 1), неврологическоеобследование с применением шкал FS и EDSS (приложения 2 и 3) а так жегенетическое обследование (на базе кафедры молекулярной биологии имедицинской биотехнологии ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МинздраваРоссии).Эпидемиологическая анкета, разработанная в 1997 году международнойрабочей группой по изучению эпидемиологии РС в мире Норвежской Академиинаук и письменности, переведенная и дополненная на кафедре неврологии,нейрохирургии и медицинской генетики ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И.
Пирогова46Минздрава России, включает следующие пункты: демографические данные,информациюоместепроживанияипрофессиональнойдеятельности,медицинский анамнез, особенности питания и стиля жизни, контакт с животными.Шкала FS разработана в 50-х годах прошлого столетия J.F.Kurtzke дляоценкистепенивовлеченностивпатологическийпроцессприРСфункциональных систем. Данная шкала состоит из 8 пунктов оценкиневрологического статуса: пирамидные нарушения, мозжечковые нарушения,стволовые нарушения, чувствительные расстройства, тазовые расстройства,зрительные нарушения и психические расстройства.
Степень пораженияфункциональных систем оценивается от 0 до 5-6 баллов, где 0 – это норма.Шкала EDSS разработана для суммарной оценки степени неврологическогодефицита и влияния выявленного дефицита на жизнедеятельность больного.Данная шкала позволяет регистрировать даже незначительные изменения вдинамике состояния больного. Градация проводится от 0 баллов (норма) до 10баллов (смерть в результате рассеянного склероза) с шагом 0.5 баллов.На третьем этапе проводился комплексный анализ полученных данных сучастием группы генетиков, возглавляемой проф. Фаворовой О.О. (кафедрамолекулярной биологии и медицинской биотехнологии ФГБОУ ВО РНИМУ им.Н.И.
Пирогова Минздрава России).Наоснованииполученныхданныхпроизведенрасчетпоказателяраспространенности АВРС и ППРС по отношению к общей популяции больныхРС в регионе. Произведена оценка следующих показателей: средний возраст намомент дебюта, характер дебюта, средняя длительность первой ремиссии, средняядлительность второй ремиссии (если применимо), степень неврологическогодефицита (с учетом шкал FS и EDSS) и скорость прогрессирования заболевания.Нейровизуализационное исследование (МРТ головного мозга) проводилосьна аппарате мощностью 1,5 Тл, по стандартной методике в Т1 и Т2 взвешенныхизображениях с толщиной среза 5мм в трех плоскостях: саггитальной,фронтальной и аксиальной.47Генетический анализ: ДНК для анализа выделяли из цельной венознойкрови с использованием коммерческих наборов QIAamp DNA Blood MidiKit(Qiagen, Германия) или с помощью модифицированного метода экстракциисмесью фенол-хлороформом. Для исследования было выбрано несколько генов иполиморфных участков, которые согласно имеющимся зарубежным публикациямвносят вклад в патогенез рассеянного склероза.
Характеристика каждого извыбранных для анализа гена и полиморфного участка представлена в таблице 2.1.Таблица 2.1 - Характеристика выбранных генов и полиморфныхучастковГен,локус1ID, нуклеотидная замена,локализация в гене2IL4,rs2243250, C>T,5q31промоторная областьПолиморфный вариантЭффект замены3Носительство аллеля T ведет к повышению уровняпродукции IL4 в клеточной линии Т-лимфоцитовчеловека [103].АллельСспособствуетснижениюэкспрессииIL6,rs1800795, G>C,цитокина за счет формирования сайта связывания7p21промоторная областьдля репрессора в промоторной области гена IL6[104].SNPIL17A,rs2275913, A>G,\6p12промоторная областьрасположенвучасткесвязываниятранскрипционного фактора NFAT в промоторнойобластигенаIL17A,изменениенуклеотиднойпоследовательности в котором ведет к снижениюуровня продукции цитокина [105].PSMB9,rs17587, G>A,6p21.3экзон 1CLEC16,rs6498169, G>A,16p13.13интрон 22CLEC16rs1640923, A>G,Наличие минорного аллеля A вызывает заменуаргинина на гистидин в позиции 60 субъединицы 9протеасомного комплекса [106].Носительство аллеля G коррелирует с повышеннымуровнем экспрессии генов DEX1 и SOCS1 в тимусе[107].SNP находится в области неравновесного сцепления481A-SOCS,2межгенная область3с rs6498169 и локусом, регулирующим экспрессию16p13.13близлежащих генов, задействованных вфункционировании иммунной системы [108]Для генотипирования всех SNP кроме rs1640923 использовали ПЦР вреальном времени с конкурирующими TaqMan-зондами.
Дизайн праймеров иTaqMan-зондов для анализа SNP в генах IL4 (rs2243250), IL6 (rs1800795) иCLEC16A (rs6498169) осуществляли с помощью онлайн-инструментов Primer 3[109]. Анализ SNP в генах IL17A (rs2275913) и PSMB9 (rs17587) осуществляли сиспользованием наборов (Thermo Fisher Scientific США). Генотипированиеполиморфного варианта в межгенной области CLEC16A-SOCS1 (rs1640923)производили методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментовпродуктов ПЦР.Для статистической обработки полученных в ходе исследования клиникоэпидемиологических данных использовали программное обеспечение Statistica6.0.
Для выборочного среднего и выборочной указывался доверительныйинтервал 95%, уровень значимости р˂0,05. Для определения значений среднихпоказателейиДостоверностьихотклоненийполученныхиспользовалиразличийописательнуюполученныхсреднихстатистику.показателей,соответствующих нормальному закону распределения, оценивали при помощи tтеста Стьюдента. Для оценки непараметрических данных использовался критерийχ2. Также был проведен кластерный анализ с целью систематизации выявленныхфакторов по степени воздействия на особенности течения заболевания.Длястатистическойобработкиполученныхгенетическихданныхиспользовали: отклонение частот аллелей/генотипов от равновесия ХардиВайнберга оценивалось с помощью критерия χ2 в онлайн-приложении SNPStats[110].Анализассоциацииисследуемыхполиморфныхучастковспредрасположенностью к РС производился путем сравнения частот аллелей,частот встречаемости аллелей/генотипов исследуемых генов, в группах больных49ППРС и здоровых индивидов.
Различия частот оценивали с помощьючетырехпольной таблицы сопряженности с использованием двустороннегокритерия Фишера с применением программы GraphPad InStat. Силу ассоциацийвыражали в отношении шансов (ОШ). Значимыми считались ассоциации, 95%доверительный интервал (ДИ) для ОШ у которых не пересекал 1, а значение pбыло меньше 0,05.
Выбор комбинаций аллелей и генотипов и анализ ихвозможной ассоциации с заболеванием проводили с применением программногообеспечения APSampler [111]. Алгоритм APSampler использует статистическийметод Монте Карло по схеме марковских цепей для поиска сочетаний признаков,носительство которых значимо ассоциировано с тем или иным состоянием(алгоритм находит сочетания признаков, частоты носительства которых сильноразличаются в сравниваемых группах и валидирует значимость этих различий спомощью стандартных статистических критериев). Статистическая значимостьвыявленных сочетаний валидируется с помощью точного критерия Фишера споправкой на множественные сравнения Бенджамини-Хохберга.
Силу ассоциацийвыражали в ОШ. Значимыми считались ассоциации, 95% ДИ для ОШ у которыхне пересекал 1. Достоверность выявленных ассоциаций сочетаний аллелей с РСверифицировали с помощью точного критерия Фишера: ассоциации считализначимыми, если значение p было меньше 0,01. Анализ неравновесного сцепленияполиморфных вариантов, расположенных в непосредственной близости друг кдругу осуществляли с помощью алгоритма HaploView [112].50Глава 3.Собственные исследования3.1.
Клинико-демографические и фенотипические характеристикигрупп больных ППРС, АВРС и РРСВ соответствие с критериями включения исследованием были охваченыследующие категории пациентов с РС: 100 пациентов с АВРС (злокачественныйРС с большими очагами в головном мозге по данным МРТ), 135 пациентов стипично протекающим РРС (группа контроля) и 111 пациентов с ППРС (средипациентов с ППРС 7 пациентов (6,31%) ранее наблюдались с диагнозомрадиологически изолированный синдромом (РИС). Критериями постановкидиагноза РИС в настоящее время является характерная для рассеянного склерозакартина МРТ и отсутствие клинических и анамнестических данных зазаболевание. Выборка проводилась по факту постановки диагнозов ППРС, АВРСи РРС (группа контроля), подтвержденных клинически и нейровизуализационно.Учету подлежали все больные в период 2012-го по 2016г.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
