Диссертация (1174192)
Текст из файла
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ«РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙМЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И. ПИРОГОВА»МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙФЕДЕРАЦИИНа правах рукописиМельниковПавел АлександровичАДРЕСНАЯ ДОСТАВКА И ИНТЕРНАЛИЗАЦИЯ ВЕКТОРНЫХНАНОКОНТЕЙНЕРОВ В КЛЕТКИ НИЗКОДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХГЛИОМСпециальность: 03.01.04 – БиохимияДиссертация на соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучные руководители:академик РАН, профессор,доктор медицинских наукЧехонин Владимир Павлович;доктор медицинских наукБаклаушев Владимир ПавловичМосква 2018ОглавлениеСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ...............................................................................
5ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................ 8Актуальность исследования .......................................................................... 8Цель и задачи исследования ........................................................................... 10Научная новизна .............................................................................................. 11Апробация диссертационной работы. ........................................................... 12Публикации ...................................................................................................... 12Объём работы ...................................................................................................
12Личный вклад автора ....................................................................................... 13ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................... 14Виды эндоцитоза и механизмы интернализации таргетных лекарственныхсредств в клетки мишени ................................................................................ 141.1.Введение ............................................................................................. 141.2.Генная терапия ...................................................................................
151.3.Катионизированные липиды ............................................................ 171.4.Пути переноса генно-терапевтического материала в клетку. ....... 181.5.Факторы, влияющие на эффективность направленной доставки, итаргетные молекулы ..................................................................................... 33ГЛАВА 2 .............................................................................................................. 45МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................. 452.1.Реактивы и расходные материалы .......................................................
452.2.Оборудование ........................................................................................ 462.3.Методы ................................................................................................... 472.3.2.Синтез липосомальных систем ..................................................... 4722.3.3.Загрузка плазмиды pCop-Green-N в катионизированныефлюоресцентно-меченные иммунолипосомы ........................................... 482.3.4.Синтез векторизованных липосомальных систем ...................... 492.3.5.Синтез наногелей ........................................................................... 502.3.6.Конъюгация наногелей ..................................................................
502.3.7.Характеристика синтезированных наночастиц ........................... 522.3.8.Иммуноферментный анализ (ИФА) ............................................. 522.3.9.Электрофорез в агарозном геле в нативных условиях ............... 532.3.10. Клеточные линии............................................................................ 532.3.11. Пробоподготовка для анализа интернализации наночастиц ..... 542.3.12. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия ................. 542.3.13. Проточная цитофлюориметрия ..................................................... 55ГЛАВА 3 ..............................................................................................................
57РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ................................... 573.1.Физико-химическая характеристика синтезированныхнаноконтейнеров........................................................................................... 573.2.Изучение селективности полученных наноконструкций к клеткамнизкодифференцированной глиомы С6 ..................................................... 583.3.Селективность векторных наногелей к клеткам глиомы С6 ......... 633.4.Изучение маршрутов интернализации полученныхнаноконтейнерных систем в клетки глиомы С6. ....................................... 653.5.Результаты ингибиторного анализа маршрутов интернализациииммунолипосом в клетки глиомы С6.
........................................................ 663.6.Результаты ингибиторного анализа маршрутов интернализациинаногелей в клетки глиомы С6 .................................................................... 693.7.Характеристики полученных катионизированных липосом ......... 7233.8.Загрузка плазмиды pCop-Green-N в катионизированныефлюоресцентно-меченные иммунолипосомы ........................................... 743.9.Проточная цитофлюориметрия ........................................................ 753.10.
Изучение интернализации НЧ с помощью конфокальноймикроскопии ................................................................................................. 77ГЛАВА 4 .............................................................................................................. 84ОБСУЖДЕНИЕ ...................................................................................................
84ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................... 89ВЫВОДЫ............................................................................................................. 90СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...............................................................................
924СПИСОК СОКРАЩЕНИЙAPадапторный белковый комплекс (adaptor protein)AP180PtdIns(4,5) P2 связывающий белокАР2адапторный белковый комплекс 2Arf6ADP-ribosylation factor 6CBDкальмодулин-связывающий доменCHAPS(calmodulin binding domain)3-[(3-Холоамидопропил) диметиламино]1-пропансульфонатCCVsклатриновая везикула (clathrin-coated vesicles)Cdc42Cell division control protein 42 homologCLICclathrin-independent carriersCPEэнтеротоксин Clostridium perfringensDiI1,1'-октадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлоратDSPEдистеароилфосфатидилэтаноламинCxконнексинDAB2адаптерным белком цитоплазмы Disabledhomologue 2DC-Chol3β (N-(N’, N’-dimethylaminoethane)-carbamoyl)cholesterolDOPEфосфатидилэтаноламин(dioleyl phosphatidylethanolamine)DOTAP3-триметил аммоний пропан хлорида(1, 2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane)DOTMAN-[1-(2, 3-dioleyloxy) propyl]-N, N, Ntrimethylammonium chlorideEEA1антиген ранних эндосом 1 (EarlyEndosome Antigen 1)5EGFRрецептор эпидермального фактора ростаENTHepsin N-terminal homologyFCHO1FCH domain only 1FCHO2FCH domain only protein 2GAKCyclin G-associated kinaseGBMмультиформная глиобластомаGEECGlycosylphosphotidylinositol- anchored protein(GPI-AP) enriched compartmentsGFAPглиофибриллярный кислый белок(glial fibrillar acidic protein),GFPзеленый флюоресцентный белок(green fluorescent protein)GPI-АРгликозилфосфатидилинозитол -якорных белковGRKG protein-coupled receptor kinasesICAM-1межклеточный белок клеточной адгезии(intercellular cell adhesion molecule)i.d.введенная доза (injected dose)IL-1интерлейкин-1LDLрецептор липопротеинов низкой плотностиM.w.Молекулярный вес (Molecular weight)MHC-Imajor histocompatibilitycomplex class1Notchтрансмембранный белок несущий доменыEGF и DSLNumbБелок адаптер EGFR и NotchPEG-b-PMAPoly(ethylene glycol)-b-poly(methacrylic acid)(блок-сополимер полиэтиленгликоля иполиметакриловой кислоты)PI3P/PtdIns3PPhosphatidylinositol 3-phosphatePtdIns(4,5)P2фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат(phosphatidylinositol-4,5-diphosphate)6Rab5Ras-related protein Rab-5Rab7Ras-related protein Rab-7Rhoprotein GDP dissociation inhibitorsiRNAмалые интерферирующие РНК(small interfering RNA)SNX9Sorting nexin-9SPDMspectral precision distance microscopy/spectralposition determination microscopySSHвычитающая гибридизация(suppression subtractive hybridization)TMB3,3',5,5'-тетраметилбензидинVEGFсосудистый эндотелиальный фактор роста(vascular endothelial growth factor)VEGFR2тирозинкиназный рецептор фактора ростаэндотелия сосудов (vascular endothelialgrowth-factor receptor)ГЭБгематоэнцефалический барьерИФАиммуноферментный анализкДНКкомплементарная ДНККОЭКлатрин – опосредованный эндоцитозмРНКматричная РНКп.о.пары основанийПЦРполимеразная цепная реакцияПЭГполиэтиленгликоль7ВВЕДЕНИЕАктуальность исследованияСоздание систем, способных осуществлять специфический направленныйтранспорт диагностических и лекарственных препаратов из системного кровотокак клеткам-мишеням органов и тканей является одной из самых актуальных задачмедицинской биохимии и фармакологии.
Известно, что применение различныхнаноконтейнерных систем существенно улучшает фармакокинетические параметры подобных препаратов, снижает токсичность, позволяет существенно уменьшить разовые и курсовые дозы. Такие наноконтейнерные системы, как мицеллы,липосомы, полимерные наночастицы, наногели и др., способны существенно снизить системную токсичность, улучшить фармакокинетику и увеличить биодоступность диагностических и лекарственных препаратов, а также оптимизировать ихдоставку в клетки-мишени, включая как клетки глиобластом, так и клетки окружающей глиобластому тканей.Конъюгация наноконтейнеров с инертным полимером, например, высокомолекулярным полиэтиленгликолем (ПЭГ), позволяет создать инертную оболочку вокруг наноконтейнера, в значительной степени защищающей его от фагоцитозаклетками ретикуло-эндотелиальной системы, и таким образом пролонгировать действие препарата.
Различные варианты модификации ПЭГа малеимидом, биотином,аминогруппой, N-гидроксисукцинимидным эфиром и др. позволяют ковалентносвязывать с поверхностью покрытого наноконтейнера векторные молекулы какбелковой, так и небелковой природы.Хорошо известно, что липосомальные системы являются эффективными наноконтейнерами для доставки как химиотерапевтических препаратов, так и отрицательно заряженных агентов (микроРНК, вирусные и невирусные агенты) к опухолевым клеткам [1] [2] [3].
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
