Диссертация (1174192), страница 7
Текст из файла (страница 7)
д.).Интенсивность процессов эндоцитоза в VEGF-позитивных здоровых клетках посравнению со злокачественными клетками существенно ниже. Существуют важные различия в структуре сосудов: сосуды в здоровых тканях ограничивают взаимодействие препаратов со здоровыми VEGF-положительными клетками, тогда как«негерметичная» сосудистая сеть опухоли не препятствуют такому взаимодействию [171; 172]На данный момент существует несколько систем направленной доставки наоснове VEGF и его рецептора второго типа.Было показано, что липосомы, векторизованные антителами против VEGFи покрытые полиэтиленгликолем (ПЭГ) использовались в качестве наноконтейнеров.
Покрытие ПЭГ продлевало продолжительность циркуляции липосом в кровотоке, снижая системное выведение и поглощение макрофагами. Иммунолипосомыспецифически накапливались в VEGF + клетках глиомы С6 и U87-MG. И, крометого, на модели экспериментальной глиомы С6 крысы было показано специфическое накопление липосом в ткани опухоли in vivo [173]. В другой работе липосомы,загруженные цитостатическим препаратом цисплатином и конъюгированные с антителами против VEGF и VEGFR2, интернализовались в клетки глиомы С6 и U87MG в 2,5 раза активнее, чем невекторные липосомы [20]. Кроме того, в одном изисследований были синтезированы и охарактеризованы векторные магнитные наночастицы оксида железа, покрытые BSA, и векторизованные путем конъюгации с39mAbVEGF, что позволило визуализировать интракраниальную глиому С6 крысыпосредством МРТ [17].Рецепторы VEGF (VEGFR) представляют собой тирозинкиназные рецепторы, которые при активации их лигандом способствуют ангиогенезу и васкулогенезу [174] VEGF и VEGFR активируются в ангиогенных опухолях [175].
Было показано, что суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, конъюгированные сантителом против VEGF-R2, могут быть применены для мониторинга прогрессирования глиомы у мышей с использованием МРТ [176]. Применение золотых наночастиц, конъюгированных с антителами против VEGFR ex vivo - один из возможных терапевтических подходов для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза В-клеток. Было продемонстрировано, что анти-VEGFR наночастицы значительно более цитотоксичны в отношении злокачественных клеток по сравнению сневекторными [177].Конъюгаты антител к VEGFR также были использованы для доставки радиотерапевтических препаратов.
Декстранные магнитные наночастицы, конъюгированные с VEGFR и содержащие радиоизотопный йод-131 применялись для терапии на ксенографтной модели карциномы печени HepG2. Анализ биораспределения частиц показал, что большая часть радиоизотопа локализована в опухолевомочаге. При этом, скорость регрессии опухоли была на 81% выше, чем при терапиисвободным йодом-131 [178]. В сводной таблице (Таблица 2) мы приводим списокразличных наноконструкций систематизированный по факторам, влияющим на ихинтернализацию и моделям воспроизведения (включая математические модели иметоды симуляции молекулярной динамики)40Вектор/НЧМодельРезультатыФлюоресКлеточ- НЧ размером <200центные по- ная ли- нм переносятся влистироловые ния B16 клетки путем клаНЧтрин- опосредованного эндоцитозаНЧ, модифи- Матема- Размер ~ 50 нм опцированные тическая тимален для интерадресной мо- модельнализации, эффеклекулойтивны засчет лиганд-рецепторноговзамодействия.СиликатныеНЧКлеточная линияРазмерSK-BR3Золотые НЧ,покрытыегерцептиномСреди НЧ с диапазоном размеров 25125 нм, НЧ размером 50 нм захватываются клеткаминаиболее эффективно.Клеточные линииСреди НЧ с диапазоном размеров 2100 нм, НЧ размером 40-50 нм захваSK-BR-3, тываются клеткамиSNB-19 и наиболее эффективноHeLaПолистироло- Клеточвые НЧная линияCaco-2Среди НЧ с размерами 50, 200, 500 и1000 нм, НЧ размером 100 нм захватываются клеткаминаиболее эффективно.ВыводыЛит-раСв-а НЧ/ПодходТаблица 2.
Факторы, влияющие на эффективность направленной доставки[107]1) Размер вектораможет определятьпуть его эндоцитоза и оказыватьвлияние на скорость клеточногозахвата.[179][180]2) Размер 50 нмявляется оптимальным в случаерецептор опосредованного эндоцитоза силикатных изолотых НЧ, а также квантовых точек в определенных типах опухолевых клеток.[181][182]3) Оптимальныйразмер, обеспечивающий наиболее41ФормаГликовирусные НЧКлеточная линияHeLaРецептор-опосредованный эндоцитозчрезвычайно зависел от размера. Оптимальный размерНЧ для эффективного захвата клетками составил ~ 50нм.Смешанные Клеточкомплектыми- ная лицеллы НЧнияНЧ размерами 40160 нм захватываются наиболее эффективно. Путь интернализации зависит от размера.(МНЧ)/миРНКMDAMB 231НЧ с пассивным эндоцитозомМетодсимуляции молекулярной динамикиэффективный захват частиц клетками, варьируетсяв зависимости оттипа НЧ[183][184]Эндоцитоз палочковидных НЧ происходит более эффек- 1) Катионизиротивно, чем сфериче- ванные НЧ эффективнее захваских.тываются в силуэлектростатического взаимодейКатионизиро- Клеточ- ПЭГ-гидрогели заствия с мембраванные кросс- ная ли- хватываются клетной клеток.сшитые ПЭГ ния HeLa ками быстрее, чемгидрогелисферические НЧ.[185]Золотые НЧ,покрытыетрансферриномКлеточ- Наностержни, поная ли- крытые трансферриния HeLa ном, захватываютсябыстрее, чем сферические НЧ.[186]ПолиплексыHPMAолиголизин/ДНККлеточ- Полиплексы на осная ли- нове наностержнейния HeLaинтернализуютсямедленнее, чем сферические2) На скоростьинтернализацииоказывает влияние соотношениедиаметр/длиннананостержней[6][187]42Поверхностный зарядБелки, пенетрирующие кле- НЧ содержащие адточную мембрану (CPP)ресный лигандКомплексыPAMAM/ДНККлеточные линии KB,Rat2, C6ПолиплексыКлеточ- Tf- или FAная ли- полиплексы интерния HeLa нализуются вклетки клатрин иликавеолин опосредованным эндоцитозом соответственно.Таргетная молекула предопределяет путь интернализации НЧ[188]Клеточные линииMC3T3E1Модифицированные CPP векторымогут избежатьдеградации в лизосомах[149]Tf- или FAPEI/ДНККомплексыmTAT/PEI/ДНК1.5.1.Комплексы нарушают целостностьклеточной мембраны с образованием наноразмерных пор.Комплексы интернализуются кавеолинопосредованнымэндоцитозом, минуялизосомы.Положительно за- [140;139]ряженные векторы могутбыстро связываться с клеточной мембраной ипопадать вклетки.и C2C12ЗАКЛЮЧЕНИЕВыбор наноконтейнеров для разработки средств адресной доставки химиотерапевтических агентов и терапевтических генов на сегодняшний день довольноширок и зависит от природы транспортируемого вещества и особенностей органамишени.
Для доставки цитостатических средств применяются как хорошо изученные иммунолипосомы, так и относительно новые полиэлектролитные наногели. Илипосомы, и наногели имеют широкие возможности по модификации их поверхностей как инертными полимерами (ПЭГ и др.), пролонгирующими фармакокинетику43и делающими их незаметными для клеток РЭС (так называемые stealth-липосомы),так и различными векторными молекулами, включая моноклональные и рекомбинантные антитела.Патологические опухолевые микрососуды характеризуются повышеннойэкспрессией сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и его рецептораVEGFR2, а также весьма активным VEGF-зависимым ангиогенезом, что делает соответствующие моноклональные антитела перспективной векторной молекулойдля доставки в очаг опухоли.Процесс интернализации наноструктур клеткой-мишенью на данный момент представлен широким списком маршрутов, классифицируемым по особенностям ключевых белков-адаптеров.
Конкретный механизм эндоцитоза предопределяет дальнейшую судьбу поглощенного наноконтейнера: окажется ли его содержимое в поздних эндосомах или будет высвобождено в цитоплазму, поэтому исследование механизмов интернализации адресных наноконтейнеров представляетсякрайне актуальной проблемой, решение которой может существенно обогатить перечень подходов к эффективной внутриклеточной доставке. На процесс прохождения препарата через клеточную мембрану и дальнейшее высвобождение влияетмасса факторов, в числе которых химическая природа наноконтейнера, его размер,заряд, форма, свойства конъюгированной с наноконтейнером векторной молекулы.Проведенный анализ научной литературы позволяет заключить, что применение таргетных наноконтейнерных препаратов, в частности, наногелей и иммунолипосом, векторизованных моноклональными антителами к VEGF и VEGFR2, может существенно увеличить эффективность интернализации за счёт жесткой фиксации наноконтейнера на поверхности клетки и последующего эндоцитоза.44ГЛАВА 2МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1.Реактивы и расходные материалыДля синтеза флюоресцентно-меченных катионизированных липосом использованись: Холестерин (Chol); L-альфа-фосфатидилхолин яичного желтка (PC); 1,2дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] аммониевой соли с молекулярной массой полиэтиленгликоля равной 2000г/моль(DSPE-ПЭГ);1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[мале-имид(полиэтиленгликоль)-2000] аммониевой соли (DSPE-ПЭГ-малеимид) «AvantiPolar Lipids», США.
Дидецилдиметиламмоний бромид (DDAB) и флюоресцентныйкраситель 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндо-карбоцианин перхлорат (Dil)«Fluka», Швейцария. 2-иминотиолан «Sigma-Aldrich», США; Tween-20, Triton X100; шприцевые фильтры для стерилизации образцов с диаметром пор 0,45 и 0,22мкм (Millipore, США). Мини-колонки для гель-фильтрации PD-10 (GE HealthCare,США).Для окрашивания плазмидной ДНК применяли наборы Label IT Tracker Cy5 иLabel IT Tracker Cy3 (Invitrogen, США).
Для мечения лизосом использовали краситель LysoTracker® Red DND-99 (Molecular Probes, США) и набор для бакуловирусной трансфекции , CellLight® Lysosomes-GFP, BacMam 2.0 (Molecular Probes,США). В качестве векторных молекул для модификации поверхности наночастициспользовали моноклональные антитела мыши к VEGF, VEGFR2 (ГНЦССП им.В.П. Сербского) , IgG (Invitrogen, США), Avastin (Roche Ltd., Швейцария).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
