Диссертация (1174192), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Для селективного ингибирования используют siRNA против GRAF1 [135].1.5. Факторы, влияющие на эффективность направленной доставки, итаргетные молекулыОсобенное внимание необходимо уделить влиянию поверхностного зарядананочастиц на их связывание с клеточной мембраной и интернализацию. Положительно заряженные наноконтейнерные системы способны быстро связываться сплазмалеммой посредством неспецифического электростатического взаимодействия с протеогликанами, несущими избыток анионных групп, присутствие которых дает выраженный отрицательный заряд клеточных мембран. Таким образомположительный поверхностный заряд повышает эффективность захвата частиц искорость поглощения препарата клеткой.
Необходимо заметить, что негативнойстороной положительно заряженных наночастиц является повышенная токсичность [138] [139].33Катионизированные PAMAM/ДНК-комплексы способны нарушать клеточные мембраны путем образования наноразмерных пор, при этом отрицательнымили нейтрально заряженным дендримерам не свойственно попадание в клетку таким механизмом [140].Для улучшения взаимодействия наноконтейнерных систем (особеннонейтральных или отрицательно заряженных) с клетками и повышения эффективности эндоцитоза, наночастицы можно модифицировать таргетными лигандами,которые способны специфически связываться с рецепторами на клеточной мембране и индуцировать рецептор-опосредованный эндоцитоз [141; 142]. Тип лигандов может определять путь эндоцитоза [143].
Например, конъюгация наночастиц срецептором фолиевой кислоты (FA) (ниже данная векторная конструкция будетописана более подробно), широко экспрессированным на опухолевых клетках, приводит к активации кавеолин-опосредованного пути эндоцитоза [144]. Так например, FA-модифицированные PEI/ДНК полиплексы интернализуются клетками линии HeLa кавеолин-опосредованно, что способствует эффективной доставке генотерапевтического материала путем избежания деградации в лизосомах.Однако, трудно контролировать путь эндоцитоза исключительно использованием того или иного лиганда, поскольку путь рецептор-опосредованного эндоцитоза также зависит от концентрации лиганда, типа клеток или фазы деления клеток.
Например, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) позволяет проникать препарату через мембрану различными путями эндоцитоза, в зависимости отконцентрации EGF [145].Другой стратегией, позволяющей влиять на интернализацию, является модификация наноконтейнерных конструкций с помощью белков, пенетрирующихклетки (мембрано-проникающие пептиды или cell penetrating peptides, CPPs) [146;147; 148], таких как TAT пептид (TATp, RKKRRQRRR), который представляетсобой модифицированный капсидный белок вируса иммунодефицита человека34[149], 9-аргинин-замещенный аналог ТАТ (R9-ТАТ), CADY [150] и LAH4производные [151]. Мембрано-проникающим пептидам свойственно иметь положительный заряд и гидрофобные аминокислотные остатки.Механизмы интернализации CPPs-модифицированных наноконтейнеров всееще находятся в стадии обсуждения [152; 153].
CPP-модифицированные наночастицы способны избежать деградации терапевтического содержимого в лизосомахзасчет эффективного эндосомального выхода препарата. Однако известно, чтомногим мембрано-проникающим пептидам свойственны побочные эффекты ввиде аллергических реакций и деградации в биологических жидкостях.Форма наноконтейнерной частицы также влияет на эффективность клеточного захвата. Методом симуляции молекулярной динамики (coarse-grained model) показано, что наночастицы палочковидной формы более эффективно интернализуютсяв клетки путем пассивного эндоцитоза, чем сферические наночастицы при одинаковом диаметре [154]. Катионизированные, полиэтиленгликолевые гидрогели скросс-сшивками (диаметр = 150 нм, высота = 450 нм) захватывались клеткамилинии HeLa в 4 раза быстрее, чем сферические наночастицы (диаметр = 200 нм)[6].Под термином «активный таргетинг» подразумевается поверхностная модификация наночастиц «таргетными молекулами» для увеличения их тропности к мишеням, презентируемым клетками опухоли, и как следствие - накопления в тканяхопухоли.
В качестве таких мишеней часто используются поверхностные мембранные белки, которые активно экспрессируются в опухолевых клетках [155]. Таргетными молекулами обычно являются антитела или их фрагменты, аптамеры, небольшие молекулы или олигопептиды. Модификация наночастиц поверхностными лигандами или антителами повышает эффективность их доставки в клетки, на которых экспрессируются специфические рецепторы или антигены [156]. Кроме того,некоторые лиганд-рецепторные взаимодействия способствуют активации рецептор35– опосредованных путей эндоцитоза, что еще более увеличивает эффективность доставки.Моноклональные антитела, в частности IgG, часто используются в качествевекторов для направленной доставки.
Антигенсвязывающие сайты представляютсобой лишь малую часть общего размера антител. Фрагменты F(ab)2 сохраняют обаантигенсвязывающих сайта антитела, связанные дисульфидной связью. Во многихопухолевых клетках, например, в клетках карциномы молочной железы, повышенаэкспрессия рецепторов факторов роста, таких как HER2/neu. В этом случае, в качестве таргетных молекул могут быть использованы моноклональные антитела против HER2/neu [157].
А липосомы, модифицированные моноклональными антителами против глиальных фибриллярных кислых белков или человеческих рецепторов инсулина были изучены на предмет возможности преодоления ими ГЭБ [158].Рецептор трансферрина (TfR) в силу его высокого уровня экспрессии в клетках эндотелия ГЭБ является еще одной важной мишенью для исследований рецептор –опосредованного трансцитоза через ГЭБ [159].Аптамеры представляют собой сложенные одноцепочечные олигонуклеотиды длиной 25-100 нуклеотидов, которые связываются с молекулярными мишенями [160]. Например, на модели немелкоклеточного рака легкого были исследованы наночастицы PLC-b-PEG, загруженные доксорубицином, модифицированныеРНК аптомером EpCAM-фторпиримидина, который специфически связывается свнеклеточным доменом молекул адгезии эпителиальных клеток. Наночастицы,конъюгированные с аптамером, продемонстрировали более высокую токсичностьin vitro по отношению к клеткам опухоли по сравнению с неконъюгированнымичастицами.
Кроме того, терапия мышей с ксенотрансплантатом человеческой опухоли молочной железы in vivo приводила к уменьшению опухоли на 60%.Малые молекулы, используемые в качестве векторов, включают пептиды,факторы роста и рецепторные лиганды, такие как фолиевая кислота, трансферрини RGD-пептиды. Примером такого вектора является лиганд HER2/neu (AHNP) для36направленной доставки поли лактид-гликозидных наночастиц с доцетакселом, который был исследован in vitro на HER2 – положительных клетках рака молочнойжелезы [161].Фолиевая кислота (FA) необходима для синтеза, репарации и метилирования ДНК а, следовательно, для выживания и пролиферации клеток.
Фолатный рецептор человека (FR), гликозилфосфатидилинозитол-закрепленный мембранныйбелок весом 38 кДа, обладает высокой аффинностью к FA и в настоящее время считается важным компонентом в клеточном накоплении FA, необходимым в химиотерапии. Экспрессия FR очень низка или отсутствует в большинстве нормальныхклеток и тканей, но она существенно выше в опухолях яичников, молочной железы,легких, колоректального рака, а также при опухолях головного мозга [162; 163].
Впроцессе эндоцитоза лигандсвязанный рецептор интернализуется и высвобождается в силу снижения рН в везикулах [164], после чего рециркулирует на поверхность клетки. Интересно, что ковалентное связывание небольших молекул, белкови даже липосом с гамма-карбоксильной частью FA не изменяет способности FAсвязываться с FR и подвергаться эндоцитозу клетками, несущими рецептор.
Показано, что FR-опосредованная доставка липосом усиливает противоопухолевую эффективность доксорубицина как in vitro, так и in vivo, а также позволяет преодолетьмножественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток, опосредуемуюP-гликопротеином [165].Трансферрин (Tf) представляет собой одноцепочечный гликопротеин, переносящий железо в клетки через рецептор-опосредованный эндоцитоз. Рецептортрансферрина экспрессируется на низких уровнях в большинстве нормальных тканей, но во многих типах опухолей уровень его экспрессии велик. Важным для стратегии направленной доставки является то, что связывание Tf с его рецепторами навнешней поверхности опухолевых клеток в 10-100 раз эффективнее в опухолевыхклетках, чем в нормальных клетках [166].
Эту особенность можно использовать в37системах доставки лекарств путем модификации поверхности носителя лекарственного средства Tf, который распознается и активно интернализуется в опухолевые клетки. Модифицированные трансферрином липосомы, наночастицы идендримеры были широко исследованы в последние годы. Однако, несмотря напредполагаемый терапевтический потенциал конъюгатов антител против рецептора Tf, препарат, основанный на этом свойстве и способный проникать через ГЭБ,еще не был введен в клиническую практику[167].Белок ферритин также способен к самосборке естественным образом в апоферритин, пригодный для инкапсуляции молекул интереса [168]. Апоферритинможно модифицировать с помощью распознающих лигандов для достижениянаправленной доставки препаратов к опухоли.
Такие модификации поверхностимогут предотвратить почечный клиренс и обеспечить EPR эффект, однако онитакже устраняют характерное для опухоли специфическое связывание природногоферритина.Олигопептиды также являются молекулами, используемыми для направленной доставки. Олигопептид RGD (Arg-Gly-Asp) является компонентом внеклеточного матричного белка фибронектина, способствует клеточной адгезии, регулируетмиграцию, рост и пролиферацию. Недавно носители на основе интегрина были исследованы в качестве векторов для доставки противораковых агентов при раке простаты [169; 155].VEGF является одним из важнейших медиаторов неоангиогенеза и ростаопухоли [170].
На сегодняшний день насчитывается пять членов семейства VEGF:VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D и VEGF-E. Из них VEGF-A считается наиболее важным в аспекте ангиогенеза опухоли, а его функции опосредуются взаимодействием с рецептором 1 или 2 типа (VEGFR-1 и VEGFR-2, соответственно) [170].Важность VEGF-A и VEGFR-2 в процессах неоангиогенеза предполагает, что блокада этих лиганда и рецептора может стать перспективной терапевтической стратегией для ингибирования ангиогенеза и роста опухоли. По этой причине VEGF-A38и VEGFR-2 становятся основными мишенями современных антиангиогенных агентов.Хотя VEGF и VEGFR2 также экспрессируются здоровыми клетками, система адресной доставки терапевтических препаратов к VEGF- и VEGFR2положительным клеткам опухоли может быть эффективной в силу ряда причин.Уровень экспрессии и рецептора, и его лиганда в злокачественных клетках намноговыше, чем в клетках здоровой ткани, поскольку возрастает во время развития некоторых патологических состояний (гипоксия, травма, воспаление, опухоль и т.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
