Диссертация (1174192), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Более специфическое ингибированиемакропиноцитоза может быть достигнуто путем нокдауна PAK-1 или Cdc42, используя RNAi [99; 100; 101].1.4.5.Кавеолин – опосредованный эндоцитозКавеолин–зависимый эндоцитоз, возможно, является наиболее распространенным путём клатрин-независимого рецептор-опосредованного эндоцитоза. Кавеолы - небольшие (60 - 80 нм) колбовидные инвагинации цитоплазматическоймембраны, наиболее многочисленны в фибробластах, эндотелиальных клетках,клетках гладких мышц и адипоцитах [102].
Основные мембранные белки, присутствующие в кавеолах – кавеолины. Кавеолин-1 и -2 находятся преимущественно вне мышечных клетках, в то время как присутствие кавеолина-3 характерно для клеток гладкой и скелетной мускулатуры [103]. Кавеолы могут быть сформированыпри отсутствии кавеолина-2, но не в отсутствии кавеолина-1. Кавеолины формируют олигомерные конструкции, тесно связанные с участками инвагинации клеточной мембраны, которые могут быть описаны, как липидные рафты. Как большинство липидных рафтов мембраны они также особенно богаты холестерином исфинголипидами. Важно отметить, что кавеолин-1 обнаружен не только в кавеолах,28но и в других мембрано - связанных сложных структурах (микродоменах), которыечасто, но не обязательно, связаны с липидными рафтами [104].В отличие от клатриновых везикул, формирование кавеолы идет в цитоплазме (в эндоплазматическом ретикулуме, где синтезируются кавеолины, и в комплексе Гольджи, где собираются ранние кавеолы).
Кавеолы попадают на клеточную мембрану только полностью созревшими [103].Открепление кавеол от поверхности клеток является динамин – зависимымпроцессом [105]. Открепившаяся кавеола затем сливается с ранними эндосомами[106]. В отличие от клатриновых везикул в кавеосомах не идет закисление [106].Интересным является влияние размера содержимого на путь интернализации. В ранних исследованиях было показано, что флюоресцентные частицы размером 500 нм интернализовались путем кавеолин – зависимого эндоцитоза, в то времякак частицы размером 200 нм попадали в клетку путем КОЭ [107].
В другом исследовании было показано, что частицы с размерами ≤100 нм накапливаются в кавеолах, в то время как частицы с размером в диапазоне 100-200 нм захватываютсяпутем КОЭ, а частицы диаметром > 200 нм интернализавались путем макропиноцитоза [108]. В более поздних исследованиях по интернализации двухцветных частиц, покрытых альбумином, в клетки эндотелия было установлено, что частицыменьше 40 нм захватываются клеткой в 5-10 раз эффективнее, чем 100 нм, причемв кавеолу может поступить три частицы размером 20 нм или две размером 40 нм[109].1.4.6.Флотиллин – опосредованный эндоцитозЭтот путь эндоцитоза аналогичен таковому при кавеолин -зависимом эндоцитозе: флотиллины -1 и -2 - мембранные белки, связанные с липидными рафтами(через пальмитоилирование, аналогично кавеолинам), способные образовыватьмикродомены клеточной мембраны[110; 111].
Процесс флотиллин - зависимогоэндоцитоза опосредован фосфорилированием флотиллинов Fyn киназой [112].29Было показано, что интернализация гликозилфосфатидилинозитол - якорных белков (GPI-АР) происходит посредством флотиллин - зависимого эндоцитоза[113]. Этот класс белков является чрезвычайно важным в аспекте таргетной доставки лекарственных препаратов. К этому классу принадлежит несколько рецепторов, в том числе два самых важных – рецепторы фолиевой кислоты [114]. Первоесвидетельство флотиллин – опосредованного эндоцитоза было получено для поглощения холерного энтеротоксина В и GPI-AP CD59 в клетках COS-7 [111]. Исследования флотиллин – положительных везикул показали колокализацию флотиллинов с маркерами поздних эндосом и лизосом [115; 112; 116], но не с маркерамиранних эндосом, что указывает на отличия в процессинге везикул от пути КОЭ[117].На данный момент не выявлено специфических фармакологических ингибиторов флотиллин - опосредованного эндоцитоза.
Такие препараты, как метил – β– циклодекстрин, действие которого основано на истощении холестерина, могутингибировать этот путь с той же эффективностью, с которой ингибируют другиепути так или иначе связанные с липидными рафтами. Наиболее избирательный способ воздейстия на флотиллин – опосредованный эндоцитоз заключается в использовании RNAi против флотиллинов [113; 118; 119].1.4.7.Arf6- зависимый эндоцитозArf-6 (ADP-ribosylation factor - 6) является членом семейства Ras – зависимых ГТФаз, выполняющих регуляторную функцию в процессах эндоцитоза [120].Arf-6 играет роль в КОЭ, участвуя в процессе перемещения АР2 комплекса к мембране [121]. Было выявлено, что Arf6-зависимый путь опосредует захват и переработку молекул главного комплекса гистосовместимости класса I (MHC-I).Несмотря на то, что в литературе нет прямых свидетельств того, что Arf 6-опосредованный путь эндоцитоза не связан с липидными рафтами, указывается,30что захват молекул МНС-I зависит от холестерола, а сами молекулы МНС-I преимущественно локализуются в областях мембраны, богатых липидными рафтами[122].
Было показано, что молекула CD1a, презентирующая липиды Т-клеткам, подобно MHC-I, интернализуется путем Arf6 – опосредованного эндоцитоза, [123]. Кдругим соединениям, способным интернализоваться этим путем, относятся β1-интегрин и E- кадгерин, а так же вирус Коксаки типа B3 и прионный белок PrPc [124;125; 126]. После слияния с сортировочными эндосомами ARF6- везикула возвращается обратно на клеточную мембрану. 75, [127].Подобно другим малым ГТФ-азам, Arf-6 существует в активной ГТФсвязанной и неактивной ГДФ-связанной конформациях.
Инактивация Arf-6 путемперехода из ГТФ в ГДФ является необходимым условием для переработки содержимого везикул и для слияния везикул с сортировочными эндосомами [128; 129].Показано, что нокаут гена клатрина приводит к снижению захвата молекул MHC-Iи β1-интегрина по Arf-6-опосоредованному пути эндоцитоза. Другими словами,взаимодействие между Arf-6 зависимым путем эндоцитоза и КОЭ необходимо дляпоглощения содержимиого Arf - 6-положительных везикул [130].1.4.8.CLIC/GEEC эндоцитозCLIC/GEEC путь относится к группе клатрин- и кавеолин-независимых вариантов эндоцитоза. С помощью этого механизма некоторые мембранные компоненты, например, GPI-APs (GlycosylPhosphatidylInositol -Anchored Proteins) с частью жидкости с наружной стороны мембраны могут интернализироваться вклетку [131]. При этом варианте эндоцитоза вначале образуются переносчики именуемые CLICs (Clathrin-Independent Carriers).
Такие структуры, при поглощенииклеткой мембранных компонентов, были показаны Kirkham и соавторами при изучении пути проникновения B-субъединицы холерного токсина в фибробластах.Они описали тубулярные и кольцеобразные структуры, имевшие диаметр от 40 до3180 нм, и показали, что эти везикулы имеют клатрин- и кавеолин-независимую природу [132]. В последующем, часть образованных CLICs сливаются друг с другом,образуя везикулы, богатые GPI-APs, которые были названы GEECs (GPI-APenriched early endosomal compartments), а другая часть возвращается и встраиваетсяобратно в мембрану. Образованные GEECs по мере продвижения приобретаютмаркеры PI3P, Rab5, EEA1, понижают pH, и могут сливаться с ранними эндосомами[133].Процесс образования везикул при данном виде эндоцитоза основывается наработе Cdc42, малой Rho ГТФазы необходимой для запуска механизма полимеризации актина, который в свою очередь играет ключевую роль при инвагинации клеточной мембраны.
Процесс инициируется активацией мембранного белка GBF1,который, в свою очередь, влияет на белок ARHGAP10/21 посредством адаптерногоArf1 белка. Данный механизм запускает и поддерживает работу Cdc42 [134]. Такжев процессе формирования тубулярных структур участвует белок GRAF1 (GTPaseregulator associated with focal adhesion kinase1). Это мультидоменный белок состоящий из BAR, PH, RhoGAP,SH3 и пролина [135]. BAR домен – это N-концевой домен, включающий в себя Bin, amphiphysin, RVS161/167. Предполагается, что этотдомен и PH (pleckstrin homology) домен являются мембарностабилизирующими иобладают сродством к богатым фосфатидилинозитол 4,5-бифосфатным участкаммембраны [135]. RhoGAP и C-концевой домен SH3 могут изменять активностьCdc42, взаимодействуя с регуляторными белками. Предполагается, что SH3 доменобладает дополнительным свойством связываться с богатым пролином доменомДинамина 1, и что данный комплекс Динамин + GRAF1 способствует отщеплениюобразованных тубулярных структур [135] [4].
Однако имеются противоречащиеэтому данные, что GRAF1 не обладает Dynamin-связывающей способностью [131].Этот вариант эндоцитоза используется GPI-связанными белками для захвата внеклеточной жидкости. Кроме этого он участвует в эндоцитозе других молекул. Так молекулы адгезии, например, CD44, перемещаются внутри клетки при32помощи CLIC/GEEC эндоцитоза, таким образом участвуя в процессе миграцииклетки [136]. Hernandez-Deviez и соавторы обнаружили, что дисферлин, белок,участвующий в восстановлении мышц, попадает в миоциты, имеющие пониженноеколичество белка CAV1, с помощью богатых GPI-связанными белками структур[6].На данный момент определено несколько ингибиторов этого вида эндоцитоза, но их количество не большое.
Так как CLIC/GEEC чувствителен к концентрации холестерина в мембране [131], в качестве такого ингибитора возможно использование метил-β-циклодекстрина, которое приведет к истощению мембранного холестерина. Зависимость механизма эндоцитоза от Cdc42 делает эту молекулу мишенью для ингибирования. Была показана возможность ингибирования Cdc42 Секраминаом А [137]. Еще один вариант ингибирования Cdc42 – это использованиетоксина B Клостридии диффициле [131]. Но любой из вышеперечисленных методов ингибирования является неселективным.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
