Диссертация (1174192), страница 3
Текст из файла (страница 3)
По даннымWiley Interscience Gene Therapy Trials Database вирусные терапевтические агентыиспользовались в 55% одобренных методах генной терапии в период за последнии27 лет (1990-2017 гг.). Высокая эффективность и специфичность переноса трансгена является их основным преимуществом. Вирусные препараты обладают несколькими общими недостатками: высоким уровнем риска возникновения различных побочных эффектов, связанных с повышенным уровнем иммуногенности вирусного вектора, а также с вероятной индивидуальной реакцией иммунной системыпациента на терапию.
В соответствии с протоколами клинических испытаний2007—2016 гг. наиболее часто для генотерапии применяются следующие вирусы:аденовирусы (в 21,4% протоколов), ретровирусы (18,2%), аденоассоциированныевирусы (7%) и VACCINIA (вирус коровьей оспы) (6,9%) [Wiley Interscience GeneTherapy Trials Worldwide Database]. Невирусные препараты конструируются в ка-15честве замены для вирусных векторов, [24] по сравнению с которыми первые потенциально менее иммуногенны, сравнительно легко производятся в клиническихмасштабах и более безопасны.Наиболее безопасной и эффективной стратегией доставки терапевтических генов в клетки-мишени является использование плазмидной ДНК.
Плазмиды —двуцепочечные экстрахромосомные кольцевые молекулы ДНК, давно зарекомендовавшие себя как эффективный инструмент генной инженерии [25]. К данномумоменту количество клинических испытаний плазмидных ДНК в качестве терапевтичеких генов возросло до 17,2% [Wiley Interscience Gene Therapy Trials WorldwideDatabase]. Плазмида состоит из нескольких компонентов: ориджин репликации, необходимый для репликации плазмиды в клетке, ген устойчивости к антибиотикам,необходимый для селекции содержащих плазмиду клонов бактерий и несколькотрансгенов, экспрессия которых в трансфецируемой клетке-мишени и является терапевтическим агентом, а также показателем эффективной доставки (трансгенывключают нуклеотидные последовательности генов интереса и инструменты, необходимые для их успешной репликации: энхансеры, промотеры и тд.).
[26] ДНКобладает отрицательным зарядом, а также большим молекулярным весом, а потомуне способна спонтанно проникать сквозь клеточную мембрану, и эффективностьтрансфекции так называемой «голой» («Naked plasmid DNA»), ничем не защищенной ДНК практически равна нулю.Успешная адресная доставка генно-терапевтического материала в клетки-мишени и высокий уровень биодоступности являются главными требованиями дляэффективной генной терапии.
Большинство доступных наноконтейнеров для адресной доставки на данный момент представлено множеством модификаций катионизированных липосом и полимеров функцианализированных различными векторными молекулами (для достижения таргетности наночастиц) [27]. Стратегиямодифицирования главным образом зависит от нашего понимания механизмов за-16хвата и поглощения наноконтейнера клеткой, а так же дальнейшего процесса распаковки и реализации генного материала. В дальнейшем мы сфокусируем внимание на интернализации контейнеров через мембрану, то есть рассмотрим разныепути поглощения наноконтейнерных форм ДНК.1.3.Катионизированные липидыКатионизированные липиды используются для транспорта генов и представляют собой катионные-липидные-ДНК комплексы (так же известные как липоплексы).
[28] Липоплексы один из самых универсальных инструментов для доставки терапевтического генного материала и многих других препаратов и на данный момент проходят доклинические и клинические испытания. [29], [30]. Катионные липоплексы легки и недороги в производстве, нетоксичны, неиммуногенныи могут доставлять большие полинуклиотиды в соматические клетки. Катионныелипиды состоят из трех основных доменов: положительно заряженная катионнаяголовка, линкер соединяющий катионную группу головки с гидрофобным доменом(длинна линкера может влиять на стабильность и биоразлагаемость вектора), и гидрофобную часть, которая состоит из алкильных цепей.Роль катионной головки заключается во взаимодействии с ДНК, в то времякак самоассоциируемая гидрофобная часть включает в конструкцию мицеллы илилипосомы в присутствии вспомогательных липидов, таких как dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE) или холестерин.
DOPE способен сливаться с другими липидами при воздействии низкого pH, что может быть полезным, например, в эндосомах (способствует увеличению эффективности выхода в цитозоль). Холестеринобеспечивает структурную стабильность, линкеры чувствительны к различнымбиологическим стимулам и способствуют высвобождению ДНК в определенныхусловиях (линкеры бывают перестраивающимися, деградируемыми). Самой распространенной формой катионах липидов являются липосомы. Их синтез включает17в себя стадию прямого смешивания катионных липосом и раствора ДНК, что приводит к связыванию положительно заряженных липосом и отрицательно заряженных молекул фосфата основы ДНК посредством электростатического взаимодействия.
Соотношение между зарядом липосом и отрицательным зарядом ДНКобычно влияет на размер липоплекса. Средний размер, как правило, составляетоколо 100 нм, а после формирования комплекса с ДНК около 200 нм [31]. Обычнов качестве катионах липидов выступают 1, 2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane(DOTAP), 3β (N-(N’, N’-dimethylaminoethane)-carbamoyl) cholesterol (DC-Chol), N[1-(2, 3-dioleyloxy) propyl]-N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA).
Катионные липиды в форме липосом выполняют ту же функцию, что и катионные полимеры - формирование комплекса с анионными ДНК. При этом наблюдается увеличение прочности конструкции за счет положительного заряда. Увеличение зарядалипоплекса сказывается на эффективности интернализации (т.к. мембрана имеетотрицательный заряд), что впоследствии сказывается на трансфицирующей способности [32]. Также катионные липосомы обеспечивают защитную функцию, создавая барьер для вне- и внутриклеточных нуклеаз.1.4.Пути переноса генно-терапевтического материала в клеткуЭндоцитоз (везикулярное поглощение внеклеточных макромолекул) - основной механизм интернализации генно-терапевтического материала.
На настоящиймомент описано несколько его типов. После эндоцитоза интернализованная клеткой молекула как правило заключена во внутриклеточную везикулу, где в дальнейшем она будет переварена. Таким образов проблема доставки генно-терапевтической информации заключается не только в преодолении плазматической мембраны, но и в избежание переваривания клеткой. Для преодоления этих проблемчасто используются липосомы и пептиды - специальные наноконструкции, выполняющие роль контейнера-переносчика, и имеющие важнейшее значение для обес-18печения успешной доставки генетического материала после эндоцитоз-опосредованного поглощения. Далее мы обсудим как эндоцитоз-опосредованный перенос,так и пути проникновения в клетку, не связанные с эндоцитозом.1.4.1.Интернализация путем эндоцитозаЭндоцитоз - процесс клеточного поглощения макромолекул и растворенныхвеществ клеткой путем инвагинации плазматической мембраны и образования вакуоли (Рис.
1.) Кинетически выделяют три типа эндоцитоза: эндоцитоз растворенных веществ, адсорбционный эндоцитоз и рецептор-опосредованный эндоцитоз.Эндоцитоз растворенных веществ - низкоэффективный и неспецифический процесс поглощения, не характеризующийся концентрированием лиганда при захвате.Ему противоположен адсорбционный и рецептор-опосредованный эндоцитоз макромолекул, связанных с плазматической мембраной и обладающий высокой специфичностью и эффективностью. При рецептор-опосредованном эндоцитозе происходит концентрирование лиганда, связанного с рецептором на поверхности клетки.Оценить эффективность такого эндоцитоза можно по коэффициенту афинностикомплекса лиганд-рецептор, и концентрации этих комплексов в клатриновой ямке.Эндоцитоз принято классифицировать на 2 большие группы: фагоцитоз (поглощение больших частиц) и пиноцитоз (поглощение жидкости или растворенных веществ).
Фагоцитоз как правило характерен для специализированных клеток млекопитающих, в то время как пиноцитоз повсеместен. Пиноцитоз можно разделитьморфологически по меньшей мере на 4 группы, которые будут различаться друг отдруга по конструкции везикулы, размеру везикулы и дальнейшей судьбе интернализованной молекулы: клатрин-зависимый, кавеолин-опосредованный, макропиноцитоз и группа клатрин/кавеолин независимых маршрутов проникновения вклетку. Рассмотрим подробнее каждый из механизмов эндоцитоза.19Рисунок 2. Схематическая классификация типов эндоцитоза.1.4.2.Клатрин–опосредованный эндоцитоз (КОЭ)На настоящий момент КОЭ является наиболее широко исследованным типомэндоцитоза.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
