Диссертация (1174192), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Активированные антитела инкубировали NH2ПЭГ-МАЛ в фосфатном буфере (10 экв., рН 7,4, 4°C, 10 ч.). Полученные ПЭГилированные антитела (антитело-ПЭГ-NH2) очищали многократным центрифугированием, используя Amicon YM-30 фильтры (10 мМ PBS, рН 7,4, 3000 об/мин, 10 мин).Затем активировали карбоксильные группы наногелей (10 экв. КДИ и N-гидроксисукцинимида (NHS), рН 5,5, 10 мин, комнатная температура) и очищали от побочных продуктов реакции на обессоливающей колонке (Sephadex G25, PBS). Активированные наногели смешивали с антитело-ПЭГ-NH2 в буфере (PBS, pH 7,4,0,15 M NaCl) и реакционную смесь перемешивали при 4°C в течение ночи. Длястимулирования гидролиза непрореагировавших NHS-эфиров и регенерации исходных карбоксильных групп рН реакционной смеси поднимали до ≥ 8 добавлением NaOH.
Конъюгаты наноконтейнеров с антителами очищали методом гельфильтрационной хроматографии на колонке (3×50 см, Sepharose CL-6B, 1 мл/мин,PBS, pH 7,4), оснащенной УФ-детектором (280 нм). Колонку калибровали с использованием декстрана синего (2000 кДа) и дрожжевой алкогольдегидрогеназы (150кДа), которые близки молекулярным весам наносистем и антител. Препараты наногелей концентрировали методом ультрафильтрации на центрифужных мембранах(100 кДа, «Millipore», США) до объема 4 мл и фильтровали через 0,45 мкм фильтры(«Millipore», США). Концентрацию антител в препаратах наногелей определяли спомощью Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay («Thermo Scientific», США) пометодике предоставленной производителем.
Активность антител подтверждаласьметодом иммуноферментного анализа.512.3.7.Характеристика синтезированных наночастицОпределение гидродинамического диаметра, индекса полидисперсности и поверхностного заряда (ζ-потенциала) липосом и наногелей осуществляли с помощью динамического лазерного светорассеяния на приборе Zetasizer Nano ZS ZEN3500 («Malvern Instruments Ltd», Англия) в ячейке «Size & Zeta potential» FoldedCapillary cell (DTS1060). Для измерений готовили растворы наночастиц в дистиллированной воде (для липосом подготавливали раствор с концентрацией липидов5 мг/мл). Средние значения для всех образцов рассчитывали, как минимум, из трехизмерений, данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение.
Оценка стабильности липосом проводилась по измерению гидродинамического радиуса и параметра полидисперсности во времени методом динамического светорассеяния.Иммунохимическую активность векторизованных антителами наночастицопределяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).2.3.8.Иммуноферментный анализПостановку ИФА проводили в 96-ти луночных полистироловых планшетах, влунках которых адсорбировали исследуемый антиген. Для этого 96-ти луночныйпланшет инкубировался на протяжении ночи при 4 C0 с 100 мкл 4 мг/мл VEGF,растворенного в 0,1 молярном NaHCO3 (8,4г NaHCO3, 800мл dH2O, pH=9,6). Послеинкубации планшет промывали с помощью фосфатного буфера PBS-T (PBS, 0,2%Tween 20, pH 7,5).
Далее в лунки вносили образцы (предварительно доведенные доконцентрации 0,4мкг/мл) и инкубировали 1 час при температуре 37 C0. Планшетпромывали 2 раза и далее вносили 100 мкл PBST. Затем добавляли 100 мкл образцас mAb (0,1 мкл/мл в PBST) и производили титровку так, чтобы в каждой следующейлунке концентрация препарата уменьшилась вдвое. Инкубировали на протяжениичаса при 37 C0, после чего отмывали 3 раза и вносили по 100 мкл раствора, содержащего вторичные антитела goat anti mouse в концентрации 1:10000. Инкубировали52на протяжении часа при 37 C0, после чего отмывали 2 раза и вносили в каждуюлунку по 100 мкл раствора субстратного буфера TMB и цитратный буфер в соотношении 2:3 соответственно.
Останавливали реакцию с помощью 3N HCl (образцырезко сменяют свою ярко-синюю окраску на желтую). Концентрацию антител, связанных с НЧ, определяли методом измерения общего белка с помощью набораCoomassie Protein Assay.2.3.9.Электрофорез в агарозном геле в нативных условияхПриготовление агарозного геля выполнялось следующим образом: 1 г агарозысуспензировали в 100 мл 1х TBE буфера с добавлением 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
5-и кратный раствор приготавливали из компонентов: Трис - 54 г, борную кислоту - 27,5 г, 0,5 М ЭДТА (рН 8,0) - 20 мл. Далее в гель вносили заранее подготовленный раствор липосом, смешанный в соотношении 5:1 с 6х буфером внесения(10 мМ Трис-HCl (рН 7,6), 0,03% бромфеноловый синий, 60% глицерин, 60 мМЭДТА).
Электрофорез проводили в 1х ТBE буфере при напряжении 2-3 В на 1 смрасстояния между электродами в течение 30-40 минут. Гель фотографировали впроходящем ультрафиолетовом свете с помощью гель-документирующей станцииImageQuant LAS4000 («GE Healthcare», Великобритания).2.3.10. Клеточные линииКультура клеток глиомы крысы С6 получена в отделе фундаментальной и прикладной нейробиологии Института В.П. Сербского из опухоли мозга крысы линииВистар, которой были имплантированы клетки перевиваемой клеточной линииглиомы крысы С6 (ATCC® CCL-107™). Клетки глиомы С6 культивировали в 25см2 пластиковых флаконах (Corning) в инкубаторе при температуре 37˚С, во влажной атмосфере с 5% CO2, на среде DMEM/F12 (Gibco) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и антибиотиков (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицином (100 мкг/мл).
Для диссоциации клеток использовали 0.25% раствор Трипсина53ЭДТА (Gibco). Для визуализации клеточных органелл применяли: LysoTracker®Red DND-99 (Molecular Probes®), CellLight® Lysosomes-GFP, BacMam 2.0(Molecular Probes®)2.3.11. Пробоподготовка для анализа интернализации наночастицКлетки линии С6 высаживали на чашки Петри 35-mm Clear Coverglass-BottomPetri-Dish (5×103 клеток на чашку). При достижении 50% плотности клеточного монослояпроизводилосьокрашиваниелизосомприпомощикрасителейLysoTracker® Red DND-99 (Ex-560 нм) или Lysosomes-GFP, BacMam 2.0 (Ex-488нм) по протоколу, предоставленному фирмой производителем. Далее клетки промывали бессывороточной средой и вносили препараты липосом в концентрации 50мкг/мл фосфатидилхолина, 5 мкг/мл антител к VEGF, KDR, Avastin в полной ростовой среде. В качестве контроля использовались невекторные липосомы и липосомы, конъюгированные с IgG.
Финальная концентрация вносимого препарата рассчитывалась на основании интенсивности флюоресценции липосом, определеннойс помощью планшетного анализатора EnSpire. Клетки с внесенными препаратамиинкубировали во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2 в течении 15, 30 и 60минут при температуре 37°С, после чего отмывали трижды DPBS и помещали вкамеру для прижизненной микроскопии.2.3.12.
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопияПутем прижизненной конфокальной лазерной сканирующей микроскопии производили оценку следующих параметров интернализации наночастиц: показательскорости интернализации каждого полученного типа НЧ, эффективнось захвата полученных НЧ клетками глиомы на основе интенсивности флюоресценции, селективность и маршрут интернализации НЧ в клетках глиом.
Для оценки скорости интернализации производили динамическое сканирование клеток после инкубации от10 до 60 минут (с интервалом в 10 мин), а затем после 90 минут инкубации, с целью54анализа динамики прохождения липосом и наногелей через плазматическую мембрану. Результатом обработки полученных изображений программным обеспечением NIS-Elements AR (Nikon) являлось колокализационное распределение флюоресцентных НЧ с флюоресцентно-меченными компартментами клеток глиомы.
Наоснове колокализационных распределений получали линейную корреляцию интенсивности флюоресценции (коэффициент корреляции пирсона rxy). Эффективностьзахвата наноконтейнеров клетками глиомы оценивали путем бинаризации полученных изображений (для исключения внеклеточной флюоресценции, а также сигнала от мембран) с помощью NIS-Elements AR. Статистическая обработка внутриклеточной интенсивности флюоресценции осуществлялась NIS-Elements AR.
Сканирование производили с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Nikon A1R MP+. В исследовании использовались лазеры с эмиссией в 405нм, 488 нм, 561 нм и 638 нм.Используемая оптика: Plan Apo 20x/0,75 Dic N, Apo IR 60x/1,27 WI и Apo TIRF60x/1,49 oil Dic объективы. Контуры клеток визуализировали с помощью дифференциально-интерференционного контраста. Обработка полученных изображенийпроизводилась с помощью программного обеспечения NIS-Elements AR (Nikon,Япония).2.3.13. Проточная цитофлюориметрияЦитофлюориметрия проводилась с помощью клеточного сортера MoFlo XDP(Beckman Coulter, США).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
