Диссертация (1174192), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Строка А – совмещенное изображение;Cтрока Б – липосомальный краситель ФИТЦ; Cтрока В — лизотреккер Red 99;Шкала - 20 мкм.После обработки в NIS-Elements AR более 500 клеток для каждого из типовнаноконтейнеров были получены средние значения интенсивности внутриклеточной флюоресценции векторных и невекторных НЧ. Наиболее высокие показателиинтенсивности внутриклеточной флюоресценции были обнаружены в случае инкубации клеток глиомы С6 с иммунолипосомами к VEGF — 510,3±60,1 УЕ. Значенияинтенсивности внутриклеточной флюоресценции для невекторных наногелей составили 220,4±56,4 УЕ, что более чем в 2 раза меньше, чем аналогичный показательдля наногелей с анти-VEGF.
Наногели, конъюгированные с IgG, Avastin и KDR,64показали меньшую внутриклеточную флюоресценцию, чем анти-VEGF иммунолипосомы: в случае с анти-KDR наногелями данный показатель составил 373,3±73,7УЕ, что является статистически не отличимым значением от векторного контроля(для NG-Avastin и NG-IgG этот показатель равен 362±73 и 357±49,5 УЕ соответственно).600Интенсивностьфлюоресценции(у.е.)510500400357,1362,2373300220,72001000Рисунок 8.
Гистограмма средних значений интенсивности внутриклеточной флюоресценции векторных и невекторных наногелей. Шкала интенсивности флюоресценции в условных единицах. (standard unit)3.4.Изучение маршрутов интернализации полученных наноконтей-нерных систем в клетки глиомы С6.Следующей задачей нашей работы было выяснение биохимических механизмовинтернализации иммунолипосом и наногелей с помощью различных ингибиторовэндоцитоза. Визуализация лизосом в этом случае осуществлялась с помощью технологии BacMam: клетки культуры С6 инкубировали на протяжении суток с моди-65фицированным бакуловирусом.
В результате трансфекции клеток глиомы С6 начиналась экспрессия гена зеленого флюоресцентного белка в лизосомах. Также использовался LisoTracker Red 99. В качестве ингибитора клатрин-зависимого эндоцитоза использовался хлорпромазин (воздействующий на AP-2 комплекс и как следствие препятствующий сборке клатринового каркаса), который инкубировали склетками до внесения наноконтейнера в концентрациях 2,5 mM, 5 mM и 10 mM напротяжении 1-4 часов. Затем клетки аккуратно отмывали и инкубировали с наноконтейнером на протяжении часа.3.5.Результаты ингибиторного анализа маршрутов интернализациииммунолипосом в клетки глиомы С6В результате этого эксперимента было установлено, что блокирование клатринопосредованного эндоцитоза почти полностью нарушает интернализацию наноконтейнеров, векторизованных специфическими моноклональными антителами кVEGF и KDR, в клетки культуры глиомы С6 (Рис.
9). Значение коэффициента корреляции Пирсона при колокализационном анализе в этом случае составляло 0,1 идля анти-VEGF, и для анти-KDR антител. Полученные результаты свидетельствуюто селективном клатрин-опосредованном эндоцитозе векторных иммунолипосом наоснове моноклональных антител к VEGF и KDR.Примечательно, что аналогичный эксперимент с невекторными липосомами илипосомами, конъюгированными с IgG, показал (Рис. 10), что уровень интернализации в клетки этих липосом в присутствии хлорпромазина изменяется не существенно. Колокализационный анализ в этом случае показал, что в присутствии хлорпромазина невекторные наноконтейнеры локализуется частично на мембране клеток, и частично – в цитоплазме клетки. Таким образом, можно предполагать различные механизмы эндоцитоза векторных и невекторных иммунолипосом.66Рисунок 9. Блокирование интернализации иммунолипосом, векторизованных с помощью моноклональных антител к VEGF и VEGFR2 с помощью ингибитора клатрин-опосредованного эндоцитоза хлорпромазина.
А - анти-VEGFлипосомы, Б - колокализационная гистограмма, B - анти-VEGFR2 липосомы. Полное отсутствие колокализации наноконтейнеров (красный канал и ось x) и лизосом(зеленый канал и ось y). Шкала - 10 мкмРисунок 10. Интернализация невекторных липосом и иммунолипосом снеспецифическими IgG в присутствии ингибитора клатрин-опосредованногоэндоцитоза хлорпромазина. Отмечается частичная интернализация липосом с неспецифическим вектором и невекторных липосом. Наноконтейнер (зеленый канали ось x) и лизосом (красный канал и ось y). Шкала - 10 мкм67Для подтверждения селективности эндоцитоза векторных иммунолипосом на основе моноклональных антител к VEGF и KDR, а так же вовлеченности молекул клатрина в процесс их интернализации, нами был проведен иммуноцитохимический анализ с применением моноклональных антител против тяжёлой цепи клатрина.
(Рис.11.)Рисунок 11. Иммуноцитохимический анализ с применением моноклональных антител против тяжёлой цепи клатрина на клетках глиомы С6. А – объединённое изображение, Б - ядра клеток С6 (Hoechst синий канал), В – краснымотмечены зоны корреляции моноклональных антител против клатрина и локализации векторных липосом, Г - антитела против клатрина (зеленый канал), Д - антиVEGF липосомы (красный канал) Е - колокализационная гистограмма. Липосомы– ось x, антитела против клатрина – ось у (Пирсоновская корреляция rxy = 0,76).Шкала - 10 мкм68На микрофотографии (Рис.
11 В.) видно, что после 40 мин инкубации иммунолипосом на основе моноклональных антител к VEGF с клетками глиомы С6, контейнер достоверно колокализован с моноклональными антителами против клатрина.Коэффициент линейной корреляции между каналами (Рис. 11 Е.) при этом достигает значения 0,76, что говорит о непосредственном участии клатрина в транспортевекторных иммунолипосом.Аналогичные эксперименты с ингибитором кавеолин-опосредованного эндоцитоза метил-β-циклодекстрином и макропиноцитоза – Цитохалазином Д показали,что в присутствии этих ингибиторов наблюдается интернализация как векторных,так и невекторных липосом, что позволило сделать вывод о несущественном вкладекавеолин-опосредованного эндоцитоза и макропиноцитоза во внутриклеточную доставку иммунолипосом.3.6.Результаты ингибиторного анализа маршрутов интернализациинаногелей в клетки глиомы С6Данный эксперимент выполнялся по вышеупомянутой схеме.
Набор ингибиторов также оставался прежним: для ингибирования клатрин-опосредованного эндоцитоза использовался хлорпромазин, кавеолин-опосредованного эндоцитоза - метил-β-циклодекстрин и макропиноцитоза – Цитохалазин Д. В результате нам удалось показать частичное ингибирование хлорпромазином интернализации наногелей, коньюгированных с антителами против VEGF и KDR. На микрофотографии(Рис.
12Б) можно наблюдать частичный захват наноконтейнеров, векторизованныханти- VEGF вектором. Пирсоновская корреляция при анализе колокализации в данном случае равна 0,3 (в контроле данная величина равна 0,7) (Рис. 13 Б, В)69Рисунок 12. Блокирование интернализации наногелей, векторизованных спомощью моноклональных антител к VEGF и VEGFR2 с помощью ингибитора клатрин-опосредованного эндоцитоза хлорпромазина. А - анти-VEGFR2наногели, Б - анти-VEGF наногели. Шкала - 10 мкмРисунок 13. Блокирование интернализации наногелей, векторизованных спомощью моноклональных антител к VEGF и VEGFR2 с помощью ингибитора клатрин-опосредованного эндоцитоза хлорпромазина. А - анти-VEGFR2наногели, Б - анти-VEGF наногели, В – Контроль (анти-VEGF наногели, 1 час инкубации). Частичное отсутствие колокализации наноконтейнеров (красный канал иось у) и лизосом (зеленый канал и ось х).
Шкала - 10 мкм70Таким образом, в экспериментах in vitro на культуре клеток низкодифференцированной глиомы С6 в результате ингибиторного анализа было утановлено, что иммунолипосомы демонстрируют селективный клатрин-зависимый и более быстрыйтип проникновения в клетки глиомы, нежели векторные наногелевые конструкции,которым характерен смешанный клатрин и кавеолин опосредованный маршрут проникновения в клетку. Установленная селективность интернализации векторных липосом в клетки глиомы С6 делает данный наноконтейнер достойным кандидатом длядоставки геннотерапевтического материала.
Это подтверждается моногочисленными данными статей описывающих значимость клатрин-зависимого эндоцитоза винтернализации вирусных и невирусных терапевтических агентов.Плазмидная ДНК pCop-Green-NВ результате трансформирования компетентных клеток XL-blue (Евроген)была получена плазмида pCop-Green-N, которая визуализировалась с помощьюэлектрофореза и была способна к стабильной трансфекции клеток линии С6.Рисунок 14.
Трансфекция клеток линии глиомы С6 плазмидной ДНКpCop-Green-N (А и Б) Шкала - 20 мкм. Электрофореграмма плазмидной ДНКpCop-Green-N (1В, 2-ой и 3-й треки).71Полученную плазмидную ДНК pCop-Green-N концентрировали в буфере TRIS(pH=8.0, 0,05М). Концентрацию ДНК определяли с помощью спектрофотометраNanoVue.3.7.Характеристики полученных катионизированных липосомВ результате работы нами были синтезированы катионизированные липосомальные наночастицы различных зарядов с модифицированной поверхностьюPEG, предотвращающей захват частиц макрофагами, что существенно увеличиваетвремя циркуляции наноконтейнеров в кровеносной системе [189], меченых флюоресцентной меткой Dil и DiD (Ex-560 нм, Ex-647нм).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
