Диссертация (1174192), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Полученные наночастицыимеют различный поверхностный заряд (за счет различного содержания катионизированных липидов), что влияет на эффективность захвата клеткой (ссылка)Затем получали векторные наноконтейнеры, содержащие в качестве адресной молекулы моноклональные антитела к VEGF, KDR а также Авастин. В качестве неспецифической векторной молекулы применяли IgG мыши (Таблица 4).72ВекторнаяДиаметр липосоммолекула(M±m), нмz-потенциал (mV)DDAB5%Анти-DDAB 8%Индекс полиDDAB10%дисперсностиPDI (M±m),186 ± 0,22-2,42,67,20,09 ± 0,03Анти-KDR176 ± 0,17-2,13,17,70,06 ± 0,03Avastin180 ± 0,21-2,42,17,40,06 ± 0,02IgG170 ± 0,23-3,62,58,20,07 ± 0,03-146 ± 0,13-3,82,17,10,1 ± 0,03VEGFФлюоресцентнаяметкаDil (Ex-560 нм),DiD (Ex-647нм)Dil (Ex-560 нм),DiD (Ex-647нм)Dil (Ex-560 нм),DiD (Ex-647нм)Dil (Ex-560 нм),DiD (Ex-647нм)Dil (Ex-560 нм),DiD (Ex-647нм)Таблица 4.
Физико-химическая характеристика экспериментальных липосомальных препаратов: анти-VEGF – моноклональные антитела к VEGF164,анти-VEGFR2 – моноклональные антитела к VEGFR2, Avastin, IgG, DDAB - диметилдиоктодециламмоний бромид.Анализ физико-химических свойств иммунолипосомальных наноконтейнеровc помощью динамического лазерного светорассеяния показал, что полученные препараты липосом, конъюгированные со специфическими и неспецифическими антителами, имеют сходный средний диаметр от 170 до 186 нм, заряд -2,1 — 8,2 mV,(в зависимости от концентрации катионизированной составляющей) и индекс полидисперсности (0,06 — 0,09).
Невекторные липосомы также не отличались от векторных липосом по параметрам заряда и полидисперсности, но, вследствие отсутствия на их поверхности антител, имели меньший средний диаметр (146 ± 0,13 нм).733.8.Загрузка плазмиды pCop-Green-N в катионизированные флюорес-центно-меченные иммунолипосомыВ ходе синтеза по вышеописанному протоколу были приготовлены мультиламеллярные липосомы, из которых образовывались однослойные липидные системы (униламеллярные липосомы). Далее смесь высушивалась при помощи лиофильной сушки до образования порошка. На этапе эмульгирования липиднойпленки буфером TRIS (pH=8.0, 0,05М) в смесь добавлялась плазмида pCop-GreenN для связывания с катионным компонентом.Рисунок 15.
Электрофорез: 1- маркер массы, 2- DNA pCop Green N , 3- липосома 8% DDAB, 4 - липосома 8% DDAB+ДНКаза, 5- липосома 8% +ДНКаза +SDS,6- липосома 10% DDAB, 7- липосома 10% DDAB+ДНКаза, 8- липосома 10%+ДНКаза +SDSС помощью электрофореза в агарозном геле была продемонстрирована эффективная загрузка плазмидной ДНК pCop-Green-N в липосомальные конструкции сразличным зарядом (Рис 15). В качестве референса использовался маркер длин74ДНК 100+ bp DNA Ladder (Евроген).
Далее раствор липосом обрабатывался ДНКазой для освобождения конструкции от молекул ДНК, находящихся на поверхности НЧ. На следующем этапе НЧ обрабатывали SDS (додецилсульфат натрия – ионный детергент) для разрушения липидной конструкции и получения на электрофореграмме сигнала непосредственно от плазмидной ДНК, которая была загружена внаноконтейнер. В результате спектрофотометрии эффективная загрузка была продемонстрирована для липосом с 8% и 10% содержанием катионизированных липидов. В последующих экспериментах нами использовались НЧ с 10% содержаниемDDAB ввиду наиболее эффективной загрузки (электрофореграмма (Рис.
15) в 8-омтреке представлена ДНК очищенная от липидов, предварительно разрушенныхSDS.)3.9.Проточная цитофлюориметрияКинетика и эффективность захвата полученных липосомальных НЧ клеткамиглиомы С6 оценивали с помощью проточной цитофлюориметрии. На Рис. 16 представлены данные детекции флюоресцентной метки DiI.75Процент клеток, интернализовавштихпрепарат,%1008060LipoVEGF40KDRIgG2003060120Время инкубации, минРисунок 16.
Оценка эффективности захвата НЧ клетками глиомы С6. Lipo– накопление невекторизованных липосом; VEGF – накопление липосом, конъюгированных с моноклональными анти-VEGF антителами; KDR – накопление липосом, конъюгированных с моноклональными анти-VEGFR2 антителами; IgG – липосомы коньгированные с неспецифическим вектором.НЧ, векторизованные с помощью VEGF и KDR, более чем в 2 раза активнеезахватываются клетками во временном интервале 120 мин., чем НЧ, несущие вектор IgG и невекторные наноконструкции. Эффективность захвата, по-видимому,связана с селективностью интернализации векторных наночастиц [Мельников и соавт., 2015] и повышенным z-потенциалом VEGF и KDR НЧ [190].763.10.Изучение интернализации НЧ с помощью конфокальной микро-скопииИнтернализацию и эффективность трансфекции катионизированных иммунолипосом, загруженных pCop-Green-N, в культуре клеток С6, предварительно окрашенной Lysosomes-GFP BacMam 2.0 (EX - 488 нм), оценивали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.Рисунок 17.
Конфокальная микроскопия клеток глиомы С6. A – лизосомы(зеленый канал) и плазмида pCop-Green-N (красный канал). Шкала - 10 мкм. Б –лизосомы (зеленый канал) и плазмида pCop-Green-N (красный канал). Шкала 5мкм. В – профиль интенсивности флюоресценции на котором ось У – интенсивность, ось Х – расстояние в мкм и соответствует вектору на Рис. 17Б. Зеленые пикисоответствуют положению мембраны лизосомы, красный пик – плазмидной ДНК,заключенной в органеллу.77Для липосом, конъюгированных с антителами VEGF и VEGFR2, нам удалосьпоказать эффективную доставку частиц и локализовать плазмидную ДНК в лизосомах клеток глиомы после 30 минут инкубации препарата.
(Рис. 17) Примечательно, что для невекторных конструкций такого эффекта не наблюдалось ни через30 мин, ни через час (Рис. 18). Отсутствие достоверных различий между векторными и невекторными липосомами спустя 30 мин инкубации по данным цитофлюориметрии, вероятно, обусловлено относительно низкой чувствительностью метода по сравнению с конфокальной микроскопией. Резюмируя данные по анализуинтернализации можно заключить, что с помощью двух методов показана достоверно более высокая эффективность внутриклеточной доставки плазмидных ДНКс помощью катионизированных векторных иммунолипосом по сравнению с невекторными.Рисунок 18. Конфокальная микроскопия клеток глиомы С6.
A – лизосомы(зеленый канал) и плазмида pCop-Green-N (красный канал). Шкала - 10 мкм. Б –лизосомы (зеленый канал) и плазмида pCop-Green-N (красный канал). Шкала 5мкм. В – профиль интенсивности флюоресценции на котором ось У – интенсивность, ось Х – расстояние в мкм и соответствует вектору на рис. 4.Б78Особый интерес представляло исследовать этапы прохождения плазмиднойДНК через ядерную мембрану и высвобождение её из лизосом в процессе инкубации клеток с векторизованным препаратом.Рисунок 19. Интернализация pCop-Green-N в ядро клетки глиомы С6.Изображения А, В и Д построены идентично: (слева направо, сверху вниз.) 1. - совмещенное изображение, 2. – синий канал –ядерный хроматин, окрашенныйHoechst, 3. – зеленый канал – лизосомы, 4.
– красный канал - pCop-Green-N, 5. дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия (ДИК), зеленымобозначен синтетический канал колоколизации плазмиды и лизосом. Изображения79Б, Г и Е – Графики линейной корреляции интенсивности флюоресценции, показывающие колокализацию лизосом и плазмидной ДНК (ось Х – зеленый канал ценциилизосом; ось У – красный канал флюоресценции pCop-Green-N)На Рис. 19. представлена колокализация органелл (зеленый канал) с каналомплазмидной ДНК (красный канал) (серийное сканирование ½ кадр/сек). Изображение Рис.19.А демонстрирует, что фрагмент плазмидной ДНК заключен в лизосому(rxy=0,51).
Можно наблюдать процесс высвобождения pCop-Green-N из органеллыи снижение коэффициента корреляции Пирсона красного и зеленого каналов припереходе к изображению Рис. 19.В и Рис. 19.Д. При этом видно, что в момент падения значения rxy ниже 0,5 плазмидная ДНК локализуется в ядре клетки С6 (синийканал). Ту же картину можно наблюдать в ДИК канале – уменьшение площади пересечения красного и зеленого каналов (отображено зеленым), что свидетельствуетоб эффективной доставке содержимого наноконтейнера через плазмалемму клеткив ядро.Для визуализации плазмидной ДНК в ядре С6 клетки инкубировали на протяжении часа с иммунолипосомальным препаратом, затем отмывали PBS от не связавшихся НЧ, после фиксировали 4% параформальдегидом и проводили прижихненную конфокальную микроскопию. В опыте использовались НЧ, векторизованные с помощью VEGF, KDR, Avastin, IgG, и невекторные конструкции.
ДНК окрашивали с помощью набора Label IT Tracker Cy5, ядра - с помощью DAPI. Z-stack,полученные на конфокальной лазерной сканирующей установке, были обработаныс помощью специализированного программного обеспечения NIS-Elements AR.(Рис. 20)80Рисунок 20. 3D визуализация плазмиды ДНК pCop Green окрашенной Cy5и ядер (DAPI) клеток С6. А – стрелкой отмечены фрагменты плазмидной ДНКвстроенные в ядерную ДНК клеток опухоли (доставка VEGF-липосомами), Б – белым отмечены контуры погруженных фрагментов плзмидной ДНК в ядро клетокопухоли (доставка KDR -липосомами).В результате 3D-реконструирования клеток глиомы нами была продемонстрирована способность векторных липосомальных наноконтейнеров к эффективнойадресной доставке генотерапевтических агентов в ядро опухолевых клеток.Последняя поставленная задача заключалась в сравнении способности к эффективной трансфекции ДНК, доставленной различными типами векторизованных липосом.
НЧ на основе моноклональных антител к VEGF и KDR инкубировали с клетками глоимы С6 на протяжении 2 часов, после аккуратно отмывали и инкубировалив полной ростовой среде при +37˚С во влажной среде в течение суток для получения продукта трансфекции pCop-Green-N. Далее производили конфокальную микроскопию на живых клетках.81Рисунок 21. Трансфекция клеток глиомы С6 плазмидой pCop Green N, доставленной липосомальными НЧ. Строка А – VEGFR2 липосомы, Строка Б –VEGF липосомы, Строка В – IgG липосомы, липосомы без вектора. Столбец 1 совмещенное изображение, Столбец 2 – флюоресценция продукта экспрессии плазмиды pCop Green N, Столбец 3 - pCop Green N + Label IT Tracker Cy5, Столбец 4 профиль интенсивности флюоресценции продукта экспрессии плазмиды pCopGreen N (отложен по оси Z)82Нами производилась оценка общей интенсивности флюоресценции продуктаэкспрессии плазмидной ДНК и подсчет трансфицированных клеток (Рис. 21.Г).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
