Диссертация (1174192), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Данные обрабатывались при помощи программного обеспечения Summit V5.2.0.7477 (Beckman Coulter, США). В ходе работы для возбуждения флюоресцентной метки Dil использовался твердотельный лазер Sapphire 200mW (561 нм). Детекцию эмиссии производили с помощью 580/23 нм.(“FL12-Dil”)и 625/26 nm (“FL13-Dil”) фильтров. Клетки глиомы С6 высаживали на лунки 6-илуночных культуральных планшет (500 тысяч клеток на лунку) в среде DMEM/F1255c 10% эмбриональной бычьей сывороткой (ЭБС), пеницилином (100 ед/мл), стрептомицином (100 мкг/мл) и инкубировали при температуре 37°C во влажной атмосфере с 5% СО2 Наночастицы инкубировались с клетками глиомы С6 в несколькихвременных периодах (30, 60 и 120 мин), которые были предварительно подобраныметодом конфокальной микроскопии по вышеописанному протоколу.
После инкубации с препаратом клетки отмывали с помощью DPBS для приостановки процессазахвата НЧ. Клетки диссоциировали при помощи раствора 0.25% трипсина-EDTA,осаждали центрифугированием (1000 об/мин, 5 мин, 25°C) супернатант отбирали,после чего клетки повторно суспендировали в 1 мл раствора PBS.56ГЛАВА 3РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ3.1.Физико-химическая характеристика синтезированных нанокон-тейнеровНа первом этапе работы выполнялся подбор наноконтейнерной конструкциидля загрузки плазмидной ДНК. Выбор производился на основании эффективностизахвата клеткой и предполагаемого маршрута проникновения в клетку системынаноконтейнер- векторная молекула. Нами использовались 2 типа наноконтейнеров: катионизированные ПЭГилированные липосомы и ПЭГилированные наногели.
Оба типа наноконтейнеров подвергались модификации неспецифическимииммуноглобулинами и моноклональными антителами к VEGF и VEGFR2 (KDR).Были получены флюоресцентно-меченые катионизированные липосомальныенаноконтейнеры с модифицированной ПЭГ поверхностью, предотвращающей захват частиц макрофагами, что существенно увеличивает время циркуляции наноконтейнеров в кровотоке [189]. Затем получали «векторные» наноконтейнеры, содержащие в качестве векторов моноклональные антитела к VEGF, VEGFR2, атакже Авастин (гуманизированные антитела к VEGF, Roch). В качестве неспецифического вектора применяли IgG мыши (Таблица 3).Анализ физико-химических свойств иммунолипосомальных наноконтейнеровc помощью динамического лазерного светорассеяния показал, что полученные препараты липосом, конъюгированные со специфическими и неспецифическими антителами имеют сходный средний диаметр от 170 до 186 нм, заряд -2,1 — -3,7 mVи индекс полидисперсности (0,06 — 0,09).
Невекторные липосомы также не отличались от векторных липосом по параметрам заряда и полидисперсности, но, вследствие отсутствия на их поверхности антител имели меньший средний диаметр (146± 0,13 нм) (Таблица 3).57Таблица 3. Физико-химическая характеристика экспериментальных липосомальных препаратов№ВекторнаяДиаметрz-поте Индекс поли- Флюоресцент-молекулалипосомнциалдисперсности ная метка(M±m), нм(mV)PDI (M±m),Анти1VEGFDiD186 ± 0,22-2,30,09±0,03(Ex-647нм), ФИТЦ(ex-488 nm)DiD2Анти-KDR 176 ± 0,17-2,10,06±0,03(Ex-647нм), ФИТЦ(ex-488 nm)DiD3Avastin180 ± 0,21-2,40,06±0,02(Ex-647нм), ФИТЦ(ex-488 nm)DiD4IgG170 ± 0,23-3,70,07±0,03(Ex-647нм), ФИТЦ(ex-488 nm)DiD5-146 ± 0,13-3,80,1±0,03(Ex-647нм), ФИТЦ(ex-488 nm)3.2.Изучение селективности полученных наноконструкций к клеткамнизкодифференцированной глиомы С6В эксперименте по исследованию интернализации векторизованных липосом инаногелей, меченых с помощью DiD (Ex 647нм) или ФИТЦ (Ex 488нм), проводилось динамическое сканирование клеток после инкубации от 10 до 60 минут (с интервалом в 10 мин), а затем после 90 минут инкубации, с целью анализа динамикипрохождения липосом через мембрану.
Эксперимент проводили на клетках низко-58дифференцированной глиомы С6 с меченными LisoTracker лизосомами. Внутриклеточную локализация исследуемых НЧ описывали путем построения колоколизационных распределений флюоресцентного сигнала от наноконтейнеров и меченых органелл (лизосомы). При обработке изображений с помощью программногообеспечения NIS-Elements AR подсчитывали количество клеток, их площади и интенсивности флюоресценции. В результате этого анализа были исключены флюоресцентные сигналы от частиц не прошедших в цитоплазму клетки, а задержавшихся на поверхности плазмалеммы.Проведенный динамический анализ интернализации в течение 90 минут последобавления к клеткам глиомы меченых препаратов иммунолипосом показал, чтоскорость интернализации векторных и невекторных липосом существенно отличается.
Иммунолипосомы, векторизованные антителами к VEGF, VEGFR2 и Avastin,обнаруживались внутри клетки уже через 30 мин инкубации. В случае с липосомами модифицированными неспецифическим вектором IgG, первые внутриклеточные сигналы регистрировались через 40 мин, в то время, как для липосом, не содержащих антител, внутриклеточная локализация начинала обнаруживаться лишьспустя 60 мин инкубации (Рис.5). Колокализационный анализ иммунолипосом смечеными лизосомами через 60 минут инкубации подтвердил, что клетки глиомыС6 наиболее активно накапливают наноконтейнеры, векторизованные антителамик VEGF и VEGFR2. Результаты колокализационного анализа представлены в видеграфиков линейной корреляции Пирсона, где по оси x отложены значения интенсивности флюоресценции лизосомального трекера LisoTracker Red 99, а по оси y –интенсивности флюоресценции липосомального ФИТЦ (Рис.5.
Д). Значения коэффициентов линейной корреляции для иммунолипосом с VEGF, VEGFR2, Avastin,IgG и невекторных липосом составили 0,58; 0,46; 0,6; 0,46 и 0,43 соответственно.На представленных графиках колокализационного анализа видно, что интенсивности внутриклеточной флюоресценции векторных и невекторных иммунолипосомсущественно разнятся (Рис.5. Д).59Рисунок 5.
Анализ интернализации векторизованных липосом на клеткахглиомы С6. Обозначения: Столбец 1. — Невекторные липосомы; Столбец 2. —Липосомы с неспецифическим вектором (IgG); Столбец 3. — Липосомы конъюгированные с Avastin; Столбец 4. — Липосомы с антителами к VEGF; Столбец 5. —Липосомы с антителами к VEGFR2 (KDR). Строка А – совмещенное изображение;строка Б – липосомальный краситель ФИТЦ; строка В — лизотреккер Red 99;строка Г — дифференциальная интерференционно-контрастная микроскопия;строка Д – график колокализационного анализа (ось х – красный канал флюоресценции лизосом; ось y – зеленый канал флюоресценции липосомального ФИТЦ).Шкала - 20 мкм.60После обработки в NIS-Elements AR более 500 клеток в экспериментах для каждого из типов наноконтейнеров были получены средние значения интенсивностивнутриклеточной флюоресценции векторных и невекторных наноконтейнеров.Наиболее высокие показатели интенсивности внутриклеточной флюоресценциибыли обнаружены в случае инкубации клеток глиомы С6 с иммунолипосомами кVEGF и VEGFR2 (KDR) — 488,3±89,1 УЕ и 653,1±101,7 УЕ соответственно.
Липосомы, конъюгированные с Avastin, показали почти вдвое меньшую внутриклеточную флюоресценцию, чем иммунолипосомы с анти-KDR. Значения интенсивностивнутриклеточной флюоресценции для иммунолипосом с неспецифическими IgG иневекторных липосом составили 233,4±71,1 УЕ и 206,7±65 УЕ соответственно, чтоболее чем в 2 раза меньше, чем аналогичный показатель для иммунолипосом санти-VEGF и почти в 3 раза меньше — чем показатель иммунолипосом с антиKDR.61Интенсивностьфлюоресценции(у.е.)800700653,18600488,14500400316,3300200200,36230,381000Рисунок 6. Гистограмма средних значений интенсивности внутриклеточной флюоресценции векторных и невекторных иммунолипосом. Шкала интенсивности флюоресценции в условных единицах.
(standard unit)Исходя из результатов анализа скорости интернализации и показателей интенсивности внутриклеточной флюоресценции иммунолипосомальных наноконтейнеров можно сделать вывод, что в экспериментах in vitro на культуре клеток низкодифференцированной глиомы С6, характеризующейся повышенной химиорезистентностью, показано, что векторные иммунолипосомальные системы на основемоноклональных антител к VEGF и KDR достоверно более эффективно (в 2 и 3 разапо сравнению с невекторными липосомами соответственно) проникают внутрьклетки и таким образом могут обеспечить более высокую биодоступность наноконтейнерной формы интеркалирующего агента или генетического материала.623.3.Селективность векторных наногелей к клеткам глиомы С6Анализ процесса интернализации в динамике в течение 60 минут флюоресцентно-меченых наногелей показал, что скорость проникновения векторных и невекторных наногелей в клетки глиомы также отличается.
Наногели модифицированные с помощью VEGF, KDR, Avastin и IgG, визуализировались внутри клеткичерез 40 мин инкубации, в то время как для наногелей, не содержащих антител,внутриклеточная локализация начинала обнаруживаться спустя 50-60 мин инкубации.Колокализация НЧ с мечеными лизосомами через 60 минут инкубации подтвердила, что клетки глиомы С6 наиболее активно интернализуют наноконтейнеры,векторизованные антителами к VEGF.
Результаты колокализационного анализабыли вычеслены по аналогии с иммунолипосомами. Значения коэффициентов линейной корреляции для наногелей с VEGF, KDR, Avastin, IgG и невекторных наногелей составили 0,71; 0,65; 0,6; 0,4 и 0,37 соответственно.63Рисунок 7. Анализ интернализации векторизованных наногелей на клетках глиомы С6. Обозначения: Столбец 1. — Невекторные наногели; Столбец 2. —наногели с неспецифическим вектором (IgG); Столбец 3. — наногели конъюгированные с Avastin; Столбец 4. — наногели с антителами к VEGF; Столбец 5. — наногели с антителами к VEGFR2 (KDR).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
