Диссертация (1174192), страница 13

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 13)

Врезультате обработки полученных изображений в ПО NIS-Elements была продемонстрирована достоверная разница в способности к трансфекции между иммунолипосомами с анти-VEGF, анти-VEGFR2 и контрольными невекторными липосомами. Доля трансфицированных клеток для иммунолипосом с антителами к VEGFи VEGFR2 составила 39,3% ± 4,1% и 42,4 ± 4,8% соответственно, в то время какневекторные липосомы без антител и с неспецифическими IgG показали21,1%±3,9% и 24,6%±2,6 (p < 0,05 при сравнении значений анти- VEGFR2 и антиVEGF как с неспецифическими иммунолипосомами, так и с липосомами без антител с помощью t-критерия Стьюдента).

Средняя интенсивность флюоресценциипродукта экспрессии плазмиды не зависела от типа выбранных липосом и достоверно не отличалась в образцах клеток, обработанных векторными и невекторнымилипосомами.83ГЛАВА 4ОБСУЖДЕНИЕРазвитие нанобиотехнологии и генной терапии ставит новые задачи по внутриклеточной доставке в опухолевые клетки генноинженерных конструкций. Самымираспространенными инструментами для генной терапии являются вирусныеагенты и плазмидные ДНК.

Но высокоэффективная вирусная трансфекция на сегодняшний день не может быть применена для доставки терапевтических геноввследствие опасности инсерционного мутагенеза и иммуногенности самого вектора. [1-3] Стратегия переноса генного материала с использованием плазмиднойДНК является более безопасным методом, чем вирусная трансдукция, посколькуДНК плазмиды не встраиваются в геном клетки-мишени и существуют в виде экстрахромосомной ДНК [4, 5].Для достижения цели нашей работы по исследованию механизмов интернализации наноконтейнерных систем, векторизованных с помощью моноклональныхантител, мы выбрали полиэлектролитные наногели, как наиболее перспективныйнаноконтейнер для доставки химиотерапевтических средств (в частности – Цисплатина), а также катионизированные липосомы в качестве наиболее близких к клиническому применению наноконтейнеров для доставки терапевтических генов.В качестве белков-мишеней для внутриклеточной доставки как наногелей, таки иммунолипосом мы применили VEGF и его рецептор VEGFR2, поскольку геныэтих белков достоверно оверэкспрессированы в большинстве глиальных опухолейIII и IV грейда.

VEGFR2 при этом презентирован на мембране клеток-мишеней, вто время как VEGF имеет как водорастворимую, так и мембраноассоциированнуюизоформу (в частности, вследствие наличия гепарин-связывающего домена в аминокислотной последовательности). Конъюгация высокоаффинных моноклональных антител к этим белкам с функционализированным ПЭГом на поверхностинаноконтейнеров по нашему предположению должна была осуществить жёсткую84фиксацию наноконтейнера на поверхности клетки-мишени и, таким образом, облегчить внутриклеточную доставку вместе с интернализующимся рецептором. Крометого, мы предполагали возможность облегчения интернализации наноконтейнеров смоноклональными антителами к водорастворимому VEGF путём связывания с антигеном и последующего рецептор-опосредованного эндоцитоза. Для определения механизмов интернализации мы применяли различные селективные ингибиторы: клатрина, кавеолина и макропиноцитоза.Важным методическим аспектом нашей работы был выбор объективного метода оценки собственно интернализации наноконтейнеров, который позволил быдифференцировать сигналы от частиц, проникших в цитоплазму от сигналов частиц, зафиксированных на поверхности клеток.

Для полуколичественного исследования собственно интернализации мы применили метод колокализационного анализа флюоресцентных сигналов от внутриклеточных компартментов и меченныхнаноконтейнеров. В качестве внутриклеточных компартментов мы выбрали лизосомы, поскольку подавляющее большинство наноконтейнеров попадает в клетку ввиде первичных эндосом, которые затем, в результате слияния с лизосомами образуют поздние эндосомы. Методом линейной корреляции Пирсона оценивается пространственное совпадение флюоресцентных сигналов от меченых лизосом и наноконтейнеров. Высокое значение коэффициента линейной корреляции при этомозначает, что и содержимое лизосом и наноконтейнеры колокализуются – т.е.

находятся в составе поздних эндосом, из которых в дальнейшем действующее веществоможет высвобождаться, проникая в цитоплазму и ядро клетки. Этот методическийподход позволяет полуколичественно анализировать только те наночастицы, которые подверглись эндоцитозу.Динамический анализ интернализации меченых наноконтейнеров показал, чтовекторные наногели с антителами к VEGF и KDR проникают внутрь клетки-мишени более чем в 2 раза быстрее (по возникновению пика внутриклеточной флюоресценции), чем наногели, модифицированные неспецифическими IgG. Этот факт85был обнаружен в результате колокализационного анализа флюоресценции наноконтейнеров с мечеными лизосомами через 30 и 60 минут инкубации.

Столь существенное различие в скорости интернализации может быть объяснено только векторной функцией антител, связывающих белок-мишень на мембране глиомныхклеток.Помимо высокой скорости интернализации векторных наноконтейнеров, обработка значений внутриклеточной флюоресценции на выборке более 500 клеток длякаждого из типов наноконтейнеров, показала, что наногели с антителами к VEGFнакапливаются более чем в два раза интенсивнее, чем невекторные наногели (средние значения показателя внутриклеточной флюоресценции составили 510,3±60,1УЕ и 220,4±36,4 УЕ соответственно).С целью изучения биохимических маршрутов интернализации полученныхнаноконтейнерных систем, мы применили ингибитор клатрин-зависимого эндоцитоза хлорпромазин, ингибитор кавеолин-опосредованного эндоцитоза метил-β-циклодекстрин и ингибитор макропиноцитоза – Цитохалазин Д.Эксперименты с инкубацией флюоресцентно-меченых наноконтейнеров с клетками мишенями в присутствии хлорпромазина, метил-β-циклодекстрина, Цитохалазин Д показали, что наиболее существенный вклад в интернализацию векторныхнаноконтейнеров принадлежит клатрин-зависимому эндоцитозу, поскольку тольков присутствии хлорпромазина коэффициент корреляции Пирсона при колокализационном анализе флюоресцентных сигналов от наноконтейнеров и внутриклеточных компартментов (лизосомы) снижался до значения 0,1, что свидетельствовало онарушении интернализации наноконтейнеров, векторизованных специфическимимоноклональными антителами к VEGF и KDR.

Данный механизм оказался специфичен только для векторных наноконтейнеров, поскольку уровень интернализациив клетки наноконтейнеров с неспецифическими антителами практически не менялсяв присутствии хлорпромазина. Эти результаты позволили нам заключить, что, в от-86личие от векторных, невекторные наноконтейнеры проникают в клетки посредством неспецифических, клатрин-независимых механизмов, которые функционируют существенно медленнее и менее эффективно, чем специфический клатринопосредованный механизм.Интересные результаты были получены при анализе маршрутов интернализации векторных наногелей. В этом случае, в отличие от липосом, мы получили лишьчастичное ингибирование хлорпромазином интернализации наногелей коньюгированных с антителами против VEGF и KDR. На микрофотографии (Рис.

12Б) можнонаблюдать частичный захват наноконтейнеров, векторизованных анти- VEGF антителами. Пирсоновская корреляция при анализе колокализации в данном случаеравна 0,3 (в положительном контроле без применения хлорпромазина данная величина равна 0,7).

Неполное ингибирование интернализации векторных наногелей свидетельствует о том, что помимо специфического клатрин-опосредованного механизма, в интернализации наногелей имеют место и другие механизмы интернализации. Поскольку векторные молекулы на наногелях и липосомах были те же самые,обнаруженный феномен позволяет заключить, что собственно физико-химическиесвойства наноконтейнера могут модулировать механизмы его эндоцитоза.Для доставки плазмидных ДНК нами были выбраны катионизированные липосомы с 10% содержанием положительно заряженных липидов, поскольку в экспериментах In vitro было показано, что липосомы с таким относительным содержанием DDAB приемлемы с точки зрения цитотоксичности и при этом вследствие положительного заряда демонстрируют достаточно эффективную загрузку плазмидной ДНК.В экспериментах по оценке эффективности трансфекции с помощью катионизированных иммунолипосом, векторизованных антителами к VEGF и -VEGFR2,была показана достоверно более эффективная доставка референсного гена в клетки87мишени по сравнению с контрольными невекторными липосомами.

Эффективность трансфекции для иммунолипосом с антителами к VEGF и VEGFR2 составила39,3% ± 4,1% и 42,4 ± 4,8% соответственно, при этом невекторные липосомы безантител и с неспецифическими IgG показали 21,1%±3,9% и 24,6%±2,6 (p < 0,05 присравнении значений анти- VEGFR2 и анти-VEGF как с неспецифическими иммунолипосомами, так и с липосомами без антител с помощью t-критерия Стьюдента).Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что векторизация наноконтейнерных препаратов специфическими к клеткам-мишеням моноклональными антителами достоверно увеличивает эффективность доставки генотерапевтическойконструкции.

При этом, средняя интенсивность флюоресценции продукта экспрессии плазмиды не зависела от типа выбранных липосом, что может быть обусловлено как особенностями экспрессии гена GFP и копийностью плазмиды, так и тем,что в течение суток инкубации происходит неспецифическая интернализация невекторных наноконтейнеров, оставшихся в среде, в результате которой и нивелируются различия с векторными наноконтейнерами. Таким образом, можно заключить, что конъюгация липосом с векторными молекулами достоверно увеличиваладолю трансфицированных клеток, но не оказывала существенного влияния на количество продукта экспрессии доставляемой ДНК в системе in vitro.88ЗАКЛЮЧЕНИЕВ результате проведенной работы было продемонстрировано, что эффективность проникновения векторных иммунолипосомальных наноконтейнеров на основе моноклональных антител к VEGF, KDR и Avastin через плазматическую мембрану клеток низкодифференцированной химиорезистентной глиомы С6 существенно выше, чем невекторных наноконтейнеров.

Характеристики

Список файлов диссертации