Диссертация (1174192), страница 8
Текст из файла (страница 8)
При проведении иммуноцитохимического анализа применяли поликлональные антителакролика к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с флюоресцентной меткойAlexaFluor488 (Invitrogen, США). При проведении электрофореза в агарозном гелеиспользовали борный буфер (0.1 M, pH 8, 2-5mM EDTA). При тиолировании антител применяли 0.1 М карбонатный буфер, (рН 8,0, 2 мМ ЭДТА).45Для работы с клеточными линиями использовали ростовые среды DMEM/F-12(Gibko, США), добавки к ростовым средам L - глутамин, антибиотики, антимикотики, (Gibko, США), эмбриональную бычью сыворотку (Biowest, Франция), фосфатно – солевой буфер (pH 7.4, 0.14 M NaCl, Gibko, США), трипсин (Invitrogen,США), пластик (культуральные флаконы, пробирки, планшеты, чашки Петри,наконечники для дозаторов, стерилизующие фильтры) (Сostar, ULplast, Corning,SPL Lifesciences, Axygen Biosciences США).При синтезе липосомальных конструкций и наногелей использовались лецитин, холестерин, DSPE-PEG, DDAB, хлороформ, метанол (Sigma, США), мембранные фильтры CentriFlo CF50 (Xylem, США), центрифужные мембраны (Millipore,США), Coomassie Plus (Thermo Scientific, США), полиэтиленгликоль-б-полиметакриловой кислоты (Sigma-Aldrich, США).2.2.ОборудованиеZetasizer Nano ZS ZEN 3500 (Malvern Instruments Ltd, Англия), роторный испаритель с вакуумным насосом Laborota 4000 (Heidolph, Германия), весы электронные аналитические с точностью до 0,0001 г (Sartorius, Германия), рН-метр AB15Basic and BioBasic (Fisher Scientific, США), СО2-инкубатор (Sanyo, Япония), миницентрифуга/вортекс Microspin FV-2400 (BioSan),микроцентрифуга Minispin(Eppendorf, США), лиофильная сушка Jouan (Испания), термошейкер для иммунопланшет ST-3 (ELMI, Россия), Конфокальный лазерный сканирующий микроскопNikon A1MP (Япония).
Планшетный анализатор EnSpire (PerkinElmer, США), боксбиологической безопасности (Esco, Сингапур), центрифуга (Eppendorf, Германия),ультразвуковой дезинтегратор (Laboratory Supplies Co, США), высокоскоростнойклеточный сортер MoFlo XDP (Beckman Coulter, США).462.3.Методы2.3.1.Наработка плазмидной ДНККлетки XL-blue (Евроген, Россия) были трансформированы плазмидой pCopGreen-N. Выделение плазмиды осуществлялось с помощью набора для выделенияплазмид фирмы Qiagen (Германия).
Суспензию клеток XL-blue помещали в пробирку и центрифугировали (15 мин, 5000 об/мин), после чего отбирали супернатанти суспендировали клетки в охлажденном буфере 1, переносили клетки в пробирку,добавляли 10 мкл буфера 2, перемешивали и инкубировали в течение 5 минут прикомнатной температуре. Затем добавляли в смесь 10 мкл охлажденного буфера 3,перемешивали и инкубировали на льду в течение 20 минут, далее центрифугировали (30 мин, 12000 об/мин, 4 ° С). В течение последних 10 минут центрифугирования уравновешивали колонку Qiagen-tip 500 путем добавления 10 мл буфера QBTи пропускали полученную смесь через колонку. Супернатант переносили в 50 млпробирки и повторно пропускали через колонку.
Колонку дважды промывали 30мл буфера QC. Элюировали ДНК путем добавления 5 мл буфера QF. И собиралиэлюат в новую пробирку. ДНК осаждали в 7 мл изопропанола и центрифугировали(30 мин, 12000 об/мин, 4оС) Супернатант удаляли, добавляли 5 мл 70% этанола,осаждали (5 мин, 12000 об/ мин, 4°С). Полностью удаляли супернатант и осаждали(5 мин, 12000 об/мин, 4°С). Высушивали в течение 5 минут, ресуспендировали в500 мкл dH20, переносили в эппендорф и повторно осаждали (5 мин, 5000 об/мин).2.3.2.Синтез липосомальных системПервый этап синтеза НЧ - приготовление мультиламиллярных липосом.
Присинтезе использовали компоненты: лецитин, холестерин, DSPE-PEG, DDAB, которые растворяли в смеси хлороформ-метанол (2:1, v/v) с молярным соотношением:20, 10, 1.5 и 0.35-10 (количество катионного липида зависело от желаемого поверхностного заряда конечного продукта). В круглодонную колбу вносили 1.5 мл лецитина (10 мг/мл, 20 мкмоль), 3.9 мг холестерина. Функция DSPE-PEG (50 мг/мл),47заключалась в образовании дополнительной «щетины», которая за счет уменьшения вероятности опсонизации способствует пролонгированию циркуляции разрабатываемых липосомальных систем в кровотоке.
Для получения 1% катионизированных липосом добавляли 15 мкл растворенного в хлороформе DDAB (10 мг/мл).Для синтеза более положительно заряженных систем: 5%, 10% и 25% вводили 75,150 и 375 мкл раствора DDAB. Флюоресцентное мечение осуществляли добавлением в липосомальную эмульсию растворов липофильных меток Dil/DiD в хлороформе (10 мг/мл) или ФИТЦ по протоколу фирмы-изготовителя. Полученнуюсмесь помещали в роторный испаритель, контролируемый автоматическим вакуумным насосом. В результате проведенных манипуляций смесь в круглодоннойколбе приобретала вид тонкой липидной пленки и далее лиофилизировалась.
Послечего в колбу с пленкой вносили 2 мл подогретой до 30°С дистиллированной водыи перемешивали на встряхивателе типа «Vortex» до полной гомогенизации, далеедля образования мультиламеллярных липосом получившуюся суспензию оставляли при комнатной температуре на 1 час. Для получения униламеллярных липосом раствор подвергался эмульгированию путем многократной заморозки - разморозки в жидком азоте (около 10 раз) и 10 минутной обработки ультразвуком. В результате получали прозрачный раствор липосом, который оставляли при комнатной температуре еще на 1-2 часа.2.3.3.Загрузка плазмиды pCop-Green-N в катионизированные флюорес-центно-меченные иммунолипосомыОкрашивание плазмидной ДНК pCop-Green-N производилось с помощью наборов Label IT Tracker Cy5(Ex/Em 644/663-738 nm) и Label IT Tracker Cy3(Ex/Em561/570-620 nm).
Мечение происходило путем смешивания компонентов красителя(10x labeling Buffer A, ДНК pCop-Green-N(1мг/мл), Label IT Tracker реагент) в со-48отношениях, соответствующих протоколу производителя так, что в результате концентрация ДНК в смеси составляла 0,1мг/мл. Реакция протекала на протяжении 1часа при 37˚С.Смесь мультиламеллярных липосом высушивали при помощи лиофильнойсушки до образования порошка. На этапе эмульгирования липидной пленки буфером TRIS (pH=8.0, 0,05М) в смесь добавлялась плазмида pCop-Green-N для связывания с катионным компонентом. Далее иммунолипосомы отделяли от остальныхкомпонентов реакционной смеси и несвязанных молекул ДНК с помощью гельфильтрации на колонке с сефарозой CL-4B (~1×50 см), уравновешенной буферомTRIS (pH=8.0, 0,05М), содержащим 150 мМ NaCl. Полученные липосомы концентрировали с помощью конических мембранных фильтров CentriFlo CF50 центрифугированием при 1000 g.2.3.4.Синтез векторизованных липосомальных системМоноклональные антитела перед связыванием с липосомами тиолировали, длячего раствор антител (1- 5 мг в 1 мл 0.1 М карбонатного буфера, рН 8,0 содержащего 2 мМ ЭДТА) в течение часа инкубировали с 10-кратным молярным избытком2-иминотиолана (реактив Траута).
После инкубации не прореагировавший реагентТраута и побочные продукты реакции отделяли от активированного антитела припомощи гель-хроматографии (NAP-10 колонки, содержащие Sephadex G-25). Тиолированный таким образом белок немедленно использовали для конъюгирования слипосомами.Для конъюгирования активированные антитела смешивали со свежеприготовленными липосомами в соотношении 45 нМ антител к 20 мкМ лецитина (PBS, рН7,5).
Полученную смесь инкубировали 4 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4оС. Реакцию останавливали введением 100-кратного молярногоизбытка (по отношению к белку) 2-меркаптоэтанола, который блокирует оставшиеся несвязанными сульфгидрильные группы. Затем иммунолипосомы отделяли от49остальных компонентов реакционной смеси и несвязанных моноклональных антител с помощью гель-фильтрации на колонке с сефарозой CL-4B (~1×50 см), уравновешенной 20 мМ PBS-буфером рН 7,4, содержащим 150 мМ NaCl.
Полученныелипосомы концентрировали с помощью конических мембранных фильтров CentriFlo CF50 центрифугированием при 1000 g.2.3.5.Синтез наногелейСинтез полимерного наноконтейнера (наногеля) осуществлялся в отделе фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ «ГНЦССП им В.П.
Сербского»по методике Н.В. Нуколовой. Используемые наногели представляют собой блокиономерный комплекс, состоящий из ковалентно сшитых цепей полиэтиленгликоль-б-полиметакриловой кислоты (ПЭГ-б-ПМАК). Синтез данных наногелейвключает два этапа. Первая стадия заключается в самоорганизации блок-сополимера (ПЭГ-б-ПМАК) в блок-иономерный комплекс (БИК) в присутствии ионовдвухвалентных металлов. Блок-иономерные комплексы ПЭГ-б-ПМАК и Ca2+ былиобразованы путем добавления к водному раствору блок-сополимера 0,1 М раствораCaCl2 при рН 8,0.
Вторая стадия заключалась в формировании ковалентных сшивокв ядре БИК между карбоксильными группами полиметакриловой кислоты и аминогруппами 1,2-этилендиамина в присутствии водорастворимого карбодиимида(КДИ). После введения сшивок в БИК ионы металла удаляли хелатированием с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и последующим диализом против водыв течение двух дней. Кроме того, наногели метили флюоресцеинизотиоцинатом(ФИТЦ).
Формирование наноразмерных наногелей подтверждали методами динамического рассеяния света (ДРС).2.3.6.Конъюгация наногелейКонъюгация с моноклональными антителами осуществлялась через линкер.Для этого к полученному ранее раствору наногелей добавляли бифункциональную50NH2-ПЭГ-МАЛ связку, которая реагировала с карбоксильными группами наногелячерез концевую аминогруппу и с тиольными группами антител через малеимиднуюгруппу (МАЛ). Вначале проводили тиолирование антител по известной методике.После инкубации непрореагировавший реагент и побочные продукты реакции отделяли от активированных антител гель-фильтрационной хроматографией(Sephadex G-25, PBS, 2 мМ ЭДТА).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
