Диссертация (1174192), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Посредством этого пути происходит интернализация питательных веществ, антигенов, факторов роста и рецепторов. Данный путь эндоцитоза являетсянезависимым от липидных рафтов, однако КОЭ может быть чувствительным к истощению холестерина [33; 34]. Самыми известными рецепторами, принимающимиучастие в КОЭ, являются рецептор трансферрина [35], рецептор липопротеиновнизкой плотности (LDL)[35; 36], рецептор эпидермального фактора роста (EGFR)[37] и β2-адренорецептор [38].
Существют убедительные доказательства того, чтопроцесс КОЭ требует взамидействия между различными рецепторами, однако рецептор не обязательно должен быть в связанной форме, к примеру, другими словами, может происходит лиганд – независимая активация рецептора (например, несвязанный EGFR может быть активирован связанным β2-адренорецептором) [39].КОЭ инициируется связыванием лиганда со специфическим рецептором клеточной20мембраны, что приводит к переносу растворимой формы свободного клатрина изцитозоля на внутренний слой мембраны [40].
Клатрин образует полигональнуюрешетку на поверхности мембраны посредством связывания с комплексом белковадаптеров (adaptor protein - AP). Затем происходит инвагинация и отщепление кластеризованного фрагмента плазматической мембраны, что ведет к образованиюклатриновых везикул (clathrin-coated vesicles - CCVs) диаметром 100 до 150 нм, состоящих из полигональной клатриновой решетки. Затем происходит деполимеризация клатрина, и образуются ранние эндосомы, которые организуются в поздниеэндосомы в результате слияния друг с другом.
После чего поздние эндосомы сливаются с лизосомами.Аденозинтрифосфотазы в ранних эндосомах «накачивают» протоны, что приводит к закислению и падению рН до 6.1-6.8, далее до 5 при переходе от позднихэндосом к лизосомам. Этот процесс является необходимым для сортировки молекул, поступивших в клетку путем КОЭ. Во время подкисления некоторые веществавозвращаются обратно во внеклеточное пространстпо через эндосомы утилизации[41].В качестве ингибитора КОЭ широко используется химический препарат хлорпромазин [42; 43; 34]. Однако, следует соблюдать осторожность при использованииэтого ингибитора, так как в высоких концентрациях хлорпромазин способен увеличивать проницаемость и текучесть клеточной мембраны [44] . Кроме того, хлорпромазин оказывает ингибирующее воздействие на процессы этерификации экзогенного холестерола клеточных мембран и активность сфингомиелиназы, что может влиять на организацию мембраны.
Хорошо известно, что хлорпромазин ингибирует комплекс адапторных белков 2 (АР2) состоящего из тяжелой цепи клатринаα, β2-, µ- и σ- адаптина [45]. Помимо этого, для ингибирования комплекса адапторных белков 2 часто используются малые интерферирующие РНК [46].21Рисунок 2. Схематическая классификация типов эндоцитоза.Mayor, S. & Pagano, R. E.
Pathways of clathrin-independent endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 603-612 (2007) doi:10.1038/nrm2216.1.4.3. Механизм Клатрин-опосредованного эндоцитозаКлатриновая везикула (CCVs) представляет собой конструкцию из фрагмента липидной мембраны, включающей белки, захваченные с поверхности клеточной стенки в процессе интернализации, и наружный гексагональный каркас изклатрина. Связывают эти 2 компонента множество адапторных белковых комплексов, то есть непосредственного контакта клатрина и фрагмента липидного слоя непроисходит, что важно для понимания механизмов работы ингибиторов данноготипа эндоцитоза.[47]22Рисунок 3. Схема рецептор-опосредованного эндоцитоза.Процесс клатрин-опосредованного эндоцитоза крайне пластичен и, видимо,может быть запущен по-разному. Чаще он инициирован связыванием n-ого рецептора на поверхности клеточной мембраны с лигандом, что приводит к превращению такого рецептора в субстрат для протеинкиназ (например в случае с G-белкамиэто GRK протеинкиназа) [48].
Такой каскад заканчивается фосфорилированием исвязыванием с адаптерами β-аррестинами, Стонином, DAB2 (Disabled homologue2), AP180 или другими адаптерными конструкциями [49] [50]. Существует множество подобных адаптеров, но если обобщить, то функция каждого из них – распознавание некоторого специфического участка внутренней части мембранного рецептора и дальнейшее его связывание с AP2.
Например, Numb белок выполняетроль такого посредника в интернализации EGFR и Notch, а выше упомянутый23DAB2 – в интернализации LDL [51], [52], [53]. Весь дальнейший каскад реакцийможно разделить по стадийно на 5 ступеней. Первым шагом будет инициирование(nucleation), в котором принимают участие FCHO1/2 (F-BAR домен содержащийбелок), ответственный за искривление мембраны. Далее DAB2, AP180, стонины(синаптотагмин связывающий белок), эпсины (ENTH содержаций белок) или другая комбинация адаптерных белков + AP2 связываются с клатрином. [47], [54]. Соответственно следующим шагом будет сборка клатринового каркаса, при этом полимеризация клатрина сопровождается привлечением других белков-контролеровинвагинации клеточной стенки. Искривление цитоплазматической мембраны контролируется BAR-домен содержащими белками амфифизином, эндофилином,SNX9 и тд.
[55] [56] Каждый из этих белков также обладает способностью к связыванию с динамином [57]. GTP-аза динамин привлекается на последнем этапесборки, когда клатриновая везикула уже имеет гексагональную форму, но остаётсясвязана с мембраной мостиком.Рисунок 4. Схема рециркуляции клатрина в процессе эндоцитоза.Отщепление CCVs происходит за счет сборки динаминового кольца вокруг мостика и его полимеризации, что приводит к изменению кольцевой структуры динамина в спираль, длинна которой наращивается, до разделения мембраны и CCVs[58], [59].
Последний шаг – удаление клатрина с поверхности собранной везикулы,24которое необходимо для транспортировки и дальнейшего слияния везикулы с мишенью. В процессе деполимеризации клатринового каркаса участвует 2 основныхкомпонента: Ауксилин (GAK для головного мозга) и HSC 70. Ауксилин, выполняющий роль связующего компонента для HSC 70 и клатрина, запускает разборкуклатринового каркаса за счет дефосфорилирования AP-комплекса фосфатазой. [60][61] Адапторные белки теряют сродство к мембране после дефосфорилированиясинаптоянином [62].Таблица 1.
Характеристика основных ингибиторов эндоцитозаИнгибиторМеханизм действияДоза/Условия инкуба- Лит.цииданныеКлатрин – опосредованный эндоцитозХлорпромазин[63]65 µг/мл (30`при 37C)Гипертониче-[64]ский раствор(0.45 M sucrose) (30`при 37C)ИстощениеK+ free buffer (30`при37C)[65]внутриклеточного К+Кавеолин – опосредованный эндоцитозНистатинСвязывание с 3βгидрокси холистеро- 5 µг/мл (30`¢ at 37C)[64]Филлипинлом[64][66]Метил – β - Истощение холестерола10 мM (10 – 30`¢ at 37C) [67]циклодекстринГенестеинИнгибитор тирозинкиназы, наруше- 400 µМ/л (120`при 37C)ние связывания актина, ингибирование динамина IIДинасорИнгибирование динамина I и II80 µM (10`при 37C)[68]ClostridiumИнгибирование Rho белков,0.74 нM (60`при 37C)[69]difficile токсинучаствующих в IL2Rb опосредованном захвате25Стимуляция трафика и интернализа- 1 µM (30`при 37C)Олеиновая кис- ция кавеол[67][70]лотаМакропиноцитоз2 диметил ами- Ингибирование Na+/H+ обменника, 100 µM (60`при 37C)[71;лорид этилизо- ведущее72]кзакислениюцитозоля.
100 µM (60`при 37C)пропиламило-LY294002 вортманнин20 µM (60`при 37C)[73]рид3-метиладенин ингибируют фосфои- 10 nM (60`при 37C)[74]LY29400нозитид-3-киназу. 3-метиладенин ин- 10 мM (15` при 37C)[75]3-метиладенингибирует фосфоинозитид – 3 –киназувортманнин(PI 3 киназу). Амилориды ингибируют протеинкиназу - С3-метиладенин ингибирует слияниеранних эндосом в макропиносомы, вто время как LY294002 и вортманнининбирируют образование эндосом.Все энергозависимые процессыНизкаятемпература 4С(4С)[76]100 mM (30¢ at 37C)Азид натрияЗакисление эндосомХлорохинПредотвращение закисления 200 µM (30` при 37C)[77;Бафиломицин А1эндосом, нарушение процес- 100 нM (30` при 37C)78]Брефелдин Асов слияние эндосом и лизо- 100 нM (30` при 37C)[79]Моненсинсом[80]НигерицинЦитохалазин D5 µM (30` при 37C)5 µM (30` при 37C)Нарушение целостности мем- 1 µM (30` при 37C)[81]бран, предотвращение полиЛатрункулинСвинхолид Америзации актина.1 µM (30` при 37C)10 nM (60` при 37C)261.4.4.МакропиноцитозВ нормальных условиях макропиноцитозом называется актин – зависимыйпроцесс эндоцитоза, индуцируемый ростовыми факторами.
Путем макропиноцитоза в клетки интернализуются фрагменты жидкой среды посредством больших вакуолей (макропиносом) с различным диаметром, который может достигать 10 µм60. Помимо жидкостей путем макропиноцитоза в клетки могут попадать некоторыепептиды [82; 83; 84] некротические клетки [85; 86], а так же вирусы [87] [88]. Процесс начинается с полимеризацииа f-актина и формирования длинных выростовплазмалеммы, которые могут распространяться по всей клеточной мембране [89].Эти выросты могут либо сформировать макропиносому, либо вернуться на клеточную поверхность. Макропиносомы интернализуют большие участки клеточноймембраны[89]. В настоящее время, нет прямых доказательств того, что состав макропиносом отличается от состава цитоплазматической мембраны. Выросты могутбыть богаты маркерами липидных рафтов в силу того, что начинают формироваться на участке мембраны, богатой липидными рафтами.
О связи макропиносомс липидными рафтами также свидетельствует и то, что макропиносомы чувствительны к истощению холестерола [90].К регуляторным факторам макропиноцитоза относятся PAK-1 [91],Arf6[92], ГТФазы семейства Rho, Rac1 и белок контроля деления клетки 42 (Cdc42)[93]. Основным отличием макропиноцитоза от КОЭ является независимость этогопроцесса от динамина – 2. Дальнейшая судьба макропиносом зависит от типаклетки. В большинстве случаев макропиносомы созревают подобно классическимэндосомам [87] [94]. После захвата начинается закисление макропиносомы и экспрессируются маркеры ранних эндосом Rab5 и / или антиген ранних эндосом 1(EEA1). Затем закисление продолжается, уменьшается размер макропиносомы, иначинает экспрессироваться маркер ранних эндосом Rab7, после чего происходитслияние макропиносом с поздними эндосомами или лизосомами [87]. Такой тип27процессинга макропиносом установлен для макрофагов[94],клетокHEK293[95],COS-1 [94]и клеток эндотелия микрососудов головного мозга [96].В качестве ингибиторов макропиноцитоза используются соединения, препятствующие полимеризации актина, такие как цитохалазин D или ингибиторыфосфатидил интозитол – 3 – киназы, которые предотвращают закрытие макропиносом, например, вортманнин [97] или 3-метиладенин [98].Ингибиторами макропиноцитоза также являются амилорид и его производные, диметиламилорид и этилизопропиламилорид, нарушающие работу Na + / H +обменника клеточной мембраны [83; 96; 72], в результате чего происходит ингибирование функции Rac1 и Cdc42 белков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
